北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部攻讀碩-博士學(xué)位研究生課題研究計(jì)劃書.doc

北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部攻讀博碩士學(xué)位研究生課題研究計(jì)劃書 研 究 生 李玉霞 學(xué) 號 1411210743 年 級 2014級 院 （部） 北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心專 業(yè) 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué) 導(dǎo) 師 方征宇 課題研究開始日期: 2015年 03 月 09 日 北京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部分院培養(yǎng)辦公室制表說 明一、 本計(jì)劃書由研究生本人在本學(xué)科內(nèi)作過開題報告后填寫，一式三份；經(jīng)院(部)主管部門批準(zhǔn)后一份留教研室，一份留院（部）主管部門，一份送研究生院醫(yī)學(xué)部分院培養(yǎng)辦公室備案。二、 計(jì)劃批準(zhǔn)后不得隨意更改。如有特殊情況確需變更者，需填寫變更報告，逐級審批。研究課題名稱黑色素瘤順鉑獲得性耐藥相關(guān)microRNA篩選及其功能的研究研究課題的目的、理論與實(shí)際意義、國內(nèi)外研究情況簡介課題的目的：1、構(gòu)建黑色素瘤順鉑獲得性耐藥細(xì)胞株，與其原始株進(jìn)行microRNA的高通量篩選比較，找到耐藥相關(guān)的microRNA，作為潛在的治療靶點(diǎn)。2、分析耐藥相關(guān)microRNA通過調(diào)控哪些基因的表達(dá)來影響黑色素瘤細(xì)胞的耐藥性，闡明其分子機(jī)制。理論與實(shí)際意義：近幾十年來,惡性黑色素瘤在全球的發(fā)病率迅猛升高,成為所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤,年增長率幾乎達(dá)到3-5%。其中白色人種發(fā)病率明顯高于其他人種, ,我國和日本等亞洲國家的黑色素瘤發(fā)病率與歐美國家相比相對較低,但近年來其發(fā)病率呈迅猛上升趨勢。惡性黑色素瘤治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療及生物免疫治療等?；熢趷盒院谏亓鲋委熤腥哉加兄匾匚?。目前化療藥物主要有順鉑、長春新堿和組蛋白去乙?；敢种苿┑?。順鉑是現(xiàn)在臨床上多種化療方案中的主要藥物之一,通過與癌細(xì)胞的脫氧核糖核酸發(fā)生交叉聯(lián)結(jié),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起抗癌作用,屬細(xì)胞增殖周期非特異性藥物，但是多種惡性黑色素瘤常會對順鉑產(chǎn)生天然或獲得性耐藥,因而提高順鉑的抗腫瘤作用,解決順鉑耐藥在惡性黑色素瘤的化療中有著重要的實(shí)際意義。 順鉑耐藥機(jī)制,主要包括細(xì)胞內(nèi)藥物積累的減少，DNA損傷修復(fù)作用增強(qiáng),凋亡通路的變化以及一些microRNA的異常表達(dá)。由于microRNA的表達(dá)易于調(diào)控，如果能找到黑色素瘤中與耐藥相關(guān)的microRNA，可建立以此為靶點(diǎn)的干預(yù)手段。國內(nèi)外研究情況簡介：在其他腫瘤細(xì)胞中，已經(jīng)有人驗(yàn)證出一些microRNA的變化會影響腫瘤對順鉑的敏感性，而目前關(guān)于microRNA在黑色素瘤順鉑獲得性耐藥機(jī)制中的作用研究較少。主要研究內(nèi)容研究內(nèi)容1：構(gòu)建黑色素瘤順鉑耐藥株選取了七種黑色素瘤細(xì)胞系M7、M21 、SK-MEL-103、M29 、A375、M8 、SK-MEL-19依次檢測對順鉑的敏感性,在對順鉑比較耐受的細(xì)胞株中選取了A375、M8、SK-MEL-19構(gòu)建了順鉑耐藥株并將A375、M8做了microRNA的表達(dá)譜芯片。研究內(nèi)容2：黑色素瘤順鉑耐藥株與原始株microRNA芯片分析及驗(yàn)證通過分析microRNA表達(dá)譜芯片，對黑色素瘤順鉑耐藥株中異常表達(dá)的microRNA用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，確定要研究的microRNA。研究內(nèi)容3: 順鉑耐藥相關(guān)基因反向篩選預(yù)測microRNA查閱文獻(xiàn)，匯總順鉑耐藥相關(guān)基因，在黑色素瘤順鉑耐藥株與原始株中用熒光定量PCR驗(yàn)證，根據(jù)耐藥基因的變化反向預(yù)測microRNA。研究內(nèi)容4：microRNA對黑色素瘤順鉑耐藥的影響及其分子機(jī)制 根據(jù)microRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫找到靶基因，進(jìn)一步研究microRNA對順鉑黑色素瘤耐藥的影響及其分子機(jī)制。主要研究方法1、 構(gòu)建黑色素瘤順鉑耐藥株MTS法檢測藥物敏感性以及順鉑耐藥株的耐藥指數(shù)。2、 黑色素瘤順鉑耐藥株與原始株microRNA芯片分析及驗(yàn)證Real-time PCR驗(yàn)證microRNA芯片結(jié)果。3、 順鉑耐藥相關(guān)基因反向篩選預(yù)測microRNAReal-time PCR驗(yàn)證順鉑耐藥相關(guān)基因，microRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果。4、 microRNA對黑色素瘤順鉑耐藥的影響及其分子機(jī)制Dual-Luciferase Reporter驗(yàn)證microRNA與靶基因的關(guān)系，慢病毒構(gòu)建靶基因相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，Western Blotting驗(yàn)證靶基因相關(guān)蛋白的變化。研究進(jìn)度及具體安排2015年3月-2015年8月進(jìn)度：黑色素瘤順鉑耐藥株構(gòu)建2015年9月-2015年12月進(jìn)度：microRNA芯片分析及驗(yàn)證,順鉑耐藥相關(guān)基因的篩選2016年1月-2016年10月安排：microRNA對黑色素瘤順鉑耐藥的影響及其分子機(jī)制的研究預(yù)期結(jié)果1、 通過microRNA芯片找到與黑色素瘤順鉑耐藥相關(guān)的microRNA2、 通過microRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫找到microRNA的靶基因3、 microRNA的靶基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白對順鉑耐藥有作用，通過敲除或者過表達(dá)該基因可以逆轉(zhuǎn)黑色素瘤順鉑獲得性耐藥。完成課題的條件協(xié)助導(dǎo)師具體指導(dǎo)的人員配備周游博士后、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員黎滿慧、試劑采購技術(shù)員董小林主要儀器設(shè)備情況Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad Rael-time PCR儀、Bio-Rad 酶標(biāo)儀、Bio-Rad 蛋白電泳儀、Eppendorf 離心機(jī)、Stuart渦旋振蕩器、Wise Therm 干浴鍋、超凈臺、顯微鏡、-20冰箱等實(shí)驗(yàn)動物情況沒有動物實(shí)驗(yàn)藥物試劑等來源情況DMEM(GIBCO)、PBS(Invitrogen)、Tyrisin(GIBCO)、MTS(Promega)、Lipofection2000(Promega)、RT kit(Promega)、Real-time supermix (Promega