紅葉芥花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆及表達(dá)分析-碩士論文

西南大學(xué) 碩士學(xué)位論文 紅葉芥花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆及表達(dá)分析 姓名：孫梓健 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士 專業(yè)：蔬菜學(xué) 指導(dǎo)教師：宋明;湯青林 20100501 摘要 紅葉芥花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆及 表達(dá)分析 蔬菜學(xué)專業(yè)碩士研究生孫梓健 指導(dǎo)教師宋明教授 湯青林副研究員 摘要 紅葉根用芥( B r a s s i c a j u n c e av a t n 印咖t r o i s ) ，以下簡(jiǎn)稱紅葉芥，是蕓薹屬芥菜種中的一 類蔬菜作物，其肉質(zhì)根主要做腌漬用，國(guó)內(nèi)栽培面積廣，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葉色獨(dú)特的 紅葉芥是根用芥菜中較為獨(dú)特的品種，其葉片從子葉展開一直呈現(xiàn)出由花青素積累而形成的 紫紅色。近年來(lái)，隨著對(duì)合成色素安全性的研究，很多對(duì)人體具有安全隱患的合成色素已不 再使用，因此，花青素作為一種安全的天然色素備受關(guān)注。類黃酮類化合物是植物次生代謝 的重要產(chǎn)物，大多數(shù)植物葉色和花色的呈現(xiàn)都是因?yàn)檫@類化合物的生成而產(chǎn)生?；ㄇ嗨厥侵?物體內(nèi)主要的類黃酮類水溶性色素，在模式植物中其生物合成途徑的研究已經(jīng)較為詳細(xì)，在 模式植物中該途徑大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因和一部分調(diào)控基因均已分離。但紅葉芥中花青素的分子調(diào) 控機(jī)理研究還沒有報(bào)道，因此對(duì)紅葉芥花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達(dá)對(duì)于闡 明紅葉芥葉色形成機(jī)理、利用基因工程進(jìn)行新品種選育和天然色素的開發(fā)利用具有重要的意 義。 本研究以紅葉芥葉片為材料，根據(jù)花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因保守序列設(shè)計(jì)特異引 物和簡(jiǎn)并引物，克隆得到P A L 、C H S 、C H I , D F R 、F 3 胃和A N S 等六個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段，利用 實(shí)時(shí)熒光定量R T - P C R 檢測(cè)了在環(huán)境脅迫下紅葉芥葉片花青素合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況 以及不同葉色根用芥菜中花青素合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下： 1 、花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆 根據(jù)已經(jīng)發(fā)布的芥菜花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因保守序列設(shè)計(jì)了特異引物或簡(jiǎn)并引物，從 紅葉芥葉片e D N A 中克隆得到了兩個(gè)基因的全長(zhǎng)c D N A ：C H I 基因( G e n b a n k A c c e s i o n ：G U 2 3 0 1 5 7 ，包含一個(gè)7 5 9 b p 的開放閱讀框) 和D F R 基因( 開放閱讀框長(zhǎng)度為1 2 0 6 b p ) ； 利用特異引物克隆得到了P A L ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G Q 5 0 5 0 6 5 ) 、C H S ( G e n b a n kA c c e s i o n ： G U 2 3 0 1 5 8 ) 、F 3 H 和A N S ( G e n b a n k A c c e s i o n ：G U 2 3 0 1 6 0 ) 基因的部分c D N A 保守序列。序 列分析表明六個(gè)結(jié)構(gòu)基因與其他植物的花青素生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因具有較高的同源性。系 統(tǒng)進(jìn)化分析表明6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因的系統(tǒng)進(jìn)化符合植物分類學(xué)的分類。 2 、環(huán)境脅迫下C H I 、D F R 和A N S 基因的表達(dá)分析 兩南大學(xué)碩+ 學(xué)何論文 利用熒光定量R T - P C R 方法分析了C H I 、D F R 和A N S 基因在環(huán)境脅迫下( 模擬干旱、低 溫和光照脅迫) 紅葉芥葉片中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：D F R 和A N S 基因在經(jīng)過(guò)環(huán)境脅迫處理 后表達(dá)量顯著增加，而C H I 基因經(jīng)過(guò)處理后表達(dá)量保持在一個(gè)較低的水平。C H I 基因雖然表 達(dá)量極低，但在不同脅迫下都有微量表達(dá)。其中低溫和光照脅迫下，D F R 和A N S 基因在處理 1 2 小時(shí)后表達(dá)量開始上升，C H I 基因表達(dá)量始終較低并無(wú)明顯變化；低溫脅迫下D F R 和A N S 基因在處理4 8 小時(shí)后達(dá)到最大值，光照脅迫下在處理后9 6 小時(shí)達(dá)到最大值；模擬干旱脅迫 下，D F R 和A N S 基因表達(dá)量均高于C H I 基因，但三者表達(dá)量都較低。 3 、根用芥菜C H S 、F 3H 、D F R 和A N S 基因的表達(dá)分析 利用熒光定量R T - P C R 方法分析了C H S 、F 3 似D F R 和A N S 基因在不同葉色根用芥菜 中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果顯示C H S 、D F R 和A N S 等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)在不同葉色根用芥菜中 花青素的積累有密切關(guān)系。在紅葉芥和綠葉芥中C H S 、D F R 和A N S 基因在第四片真葉表達(dá) 量最高，F(xiàn) 3 W 基因在兩者間差異不大；花青素含量在紅葉芥第七片真葉最高，綠葉芥中花青 素含量很低且葉片間差異不大。C H S 、D F R 和A N S 基因在紅葉芥葉片中的表達(dá)量均高于綠葉 芥葉片。 關(guān)鍵詞：紅葉芥花青素結(jié)構(gòu)基因基因克隆表達(dá)分析 A b s t r a c t C l o n i n ga n dE X lA n a l 3 o f n t h o c 0 l - - )lonInt：anx o r e s s l o nA n a l y s l s A n t t m c y a n l n B i o s y n t h e s i s G e n e si nR e dL e a fM u s t a r d M S C a n d i d a t e ：S u nZ i J i a n S u p e r v i s o r ：P r o f S o n gM i n g A s s o c i a t eR e s e a r c h e rT a n gQ i n g L i n A B S T R A C T R o o tm u s t a r di sat y p eo fp i c k l e dm u s t a r dp l a n ts t e mo r i g i n a t i n gf r o mS i c h u a n ，C h i n a I nE n g l i s h , i ti sc o m m o n l yk n o w na sS i c h u a nv e g e t a b l eo rC h i n e s ep i c k l e dv e g e t a b l e ，i n c l u d i n gt h es e v e r a l o t h e rt y p e si nt h eS i c h u a np r o v i n c ei t s e l f , t h ep i c k l ei sm a d ef r o mt h ef i s t - s i z er o o to fB r a s s i c a j u n c e a R e d l e a fm u s t a r di sau n i q u ec u l t i v a ro ft h er o o tm u s t a r d ，w h i c hh a sas t u n n i n gp u r p l el e a f c o l o rc a u s e db yt h ea c c u m u l a t i o no fa n t h o c y a n i n si nl e a v e s I nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h er e s e a r c ho f s y n t h e t i cp i g m e n t sa n dt h eh e a l t hc o n c e r r l s ，m a n ys y n t h e t i cp i g m e n tw a sn ol o n g e ri nU s e ，a n d h e n c et h ea n t h o c y a n i n st h a tp e o p l eg r a d u a l l ya c c e p t e da sas a f en a t u r a lp i g m e n t sh a sf o r m e dah u g e m a r k e t I np l a n t s ，aw e l l - k n o w np h y s i o l o g i c a lf u n c i o no ft h ef l a v o n o i dp i g m e n t si st h er e c r u i t m e n t o fp o l i n a t o r sa n ds e e dd i s p e r s e r s ，B e s i d e sp r o v i d i n gb e a u t i f u lp i g m e n t a t i o ni nf l o w e r s ，f r u i t s ，s e e d s ， a n dl e a v e s ，f l a v o n o i d sa l s oh a v ek e yr o l e si ns i g n a l i n gb e t w e e np l a n t sa n dm i c r o b e s ，i nm a l e f e r t i l i t yo fs o m es e c i e s ，i nd e f e n s ea sa n t i m i c r o b i a la g e n t sa n df e e d i n gd e t e r r e n t s ，a n di nU V p r o t e c t i o n A so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tw a t e r - s o l u b l ef i a v o n o i dp i g m e n t s ，a n t h o c y a n i n sa r et h e m o s tc o n s p i c u o u so n e ，i t sb i o s y n t h e s i sp a t h w a yh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l yi nm o d e lo r g a n i s m M o s ts t r u c t u r a lg e n e sa n dr e g u l a t o r yg e n e si nt h ep a t h w a yh a v eb e e ni s o l a t e d H o w e r v e r , t h e r ea r e n or e p o r t so nt h i ss u b j e c ti nr e d - l e a fm u s t a r d T h e r e f o r e ，t h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so f s t r u c t r a lg e n e si nr e d - l e a fm u s t a r dw i l lp r o m o t ef u r t h e rs t u d i e so nn e wc u l t i v a r sb r e e d i n ga n dt h e u t i l i z a t i o no fn a r u r a lp i g m e n t s I nt h i sr e s e a r c h , c D N Ae n c o d i n gP A L ，C H S , C H I , F 3HD F Ra n dA N Sw e r ei s o l a t e db yu s i n g s p e c i f i c o rd e g e n e r a t ep d m e r sf r o mt h el e a v e so ft h er e d l e a fm u s t a r d , a n dt h e i r e x p r e s s i o n ( e x p r e s s i o nu n d e re n v i r o n m e n ts t r e s s e sa n dt h ee x p r e s s i o ni nr e d c o m m o nl e a fm u s t a r d ) W a si n v e s t i g a t e db yr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eR T - P C R T h em a i nr e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ： A c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dm o t i f so fc l o n e dg e n e si n v o l v e di na n t h o c y a n i ns y n t h e s i s ，s p e c i f i c p r i m e r so rd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r eu s e dt oa m p l i f yt h es i xs t r u c t u r a lg e n e sf r o mr e d - l e a fm u s t a r d c u l t i v a r T h eC H Ig e n ea n dD F Rg e n ew e r ec l o n e db yu s i n gh o m o l o g y - b a s e dc l o n i n gs t r a t e g y , t h e c o m p l e m e n t a r yD N A o fC H Ig e n e ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 015 7 ) h a sa no p e nr e a d i n gf la m eo f I I I 兩南大學(xué)碩十學(xué)付論文 7 5 9 b p ，a n dt h eD F Rg e n ei s 115 7 b p ；t h ec D N Af r a g m e n t so fP A L ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G Q 5 0 5 0 6 5 ) ， C H S ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 015 8 ) ，F(xiàn) 3EA N S ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 0 16 0 ) g e n e sw e r e o b m i n e db yu s i n gs p e c i f i c p r i m e r s S e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e s eg e n e ss h a r e dh i g h s i m i l a r i t yw i t ht h o s ef r o mo t h e rp l a n t s T h er e s u l t so fp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e s y s e m a t i ce v o l u t i o no ft h o s es i xg e n e sw e r eu pt ot h e i rd i s t i n c te v o l u t i o n a r yp a t h w a y s T h ei m p a c to fe n v i r o n m e n t a ls t r e s su p o nr e d l e a fm u s t a r da n t h o c y a n i n sp r o d u c t i o na n dt h e e x p r e s s i o no fs t r u c t u r a lg e n e si n v o l v e di nt h e i rb i o s y n t h e s i ss u c h 簽c h a l c o n ei s o m e r a s e ( C H l ) ， d i h y d r o f l a v o n o l4 - r e d u c t a s e ( D F R ) a n da n t h o c y a n i n d i ns y n t h a s e ( a N S ) W a Ss t u d i e d T h er e s u l t so f r e a l - t i m eR T - P C Ra n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h ea m o u n to fa n t h o c y a n i na n dt h ee x p r e s s i o no ft h o s e s t r u c t u r a lg e n e sr e q u i r e dap e r i o do ft i m et or e a c ht h ep e a k T h ee x p r e s s i o no fD F Rg e n ea n dA N S g e n ei n d u c e db yl o w - t e m p e r a t u r ea n dl i g h t - s t r e s sl e dU St ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h et w og e n e sa r et h e i m p o r t a n ts u b j e c tf o rc h a r a c t e r i z i n gt h em o l e c u l a rr e s p o n s e st ot e m p e r a t u r ea n dl i g h ti nt h el e a fo f r e d - l e a fm u s t a r d F u r t h e r m o r e ，t h el o w - t e m p e r a t u r ea n d l i g h t - s t r e s sm i g h ti n d u c ed i f f e r e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s m si nt h ea n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i s G e n e se n c o d i n gc h a l c o n es y n t h a s e ( C H S ) ，f l a v o n o i d3 - h y d r o x y l a s e ( F 3 仞，d i h y d r o f l a v o n o l 4 - r e d u c t a s e ( D F R ) a n da n t h o c y a n i n d i ns y n t h a s e ( a N S ) w e r ea s s a y e db yu s i n gq u a n t i t a t i v e r e a l - t i m eR r - P C R i no r d e rt ot e s tt h et r a n s c r i 【p t i o nl e v e l si nt h el e a fo fr e d - l e a fm u s t a r da n d c o m m o nr o o t - m u s t a r d 1 1 1 er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs t r u c t u r a lg e n e s ( C H S , 乃E D F Ra n dA N Sg e n e s ) i nr e d l e a fm u s t a r dw a sm u c hh i g h e rt h a nt h ee x p r e s s i o ni nc o m m o n r o o t m u s t a r d ，a n dt h ee x p r e s s i o n sr e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e li nt h ef o u r t hl e a f T h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ea b s e n c eo fp i g r n e n tm a yb ec a u s e db yt h es t r u c t u r a lg e n e sd o w n - r e g u l a t e di nt h e c o m m o nr o o t m U S t a r dc u l t i v a r s K e yw o r d s ：R e d l e a fM u s t a r d ；A n t h o c y a n i n ；S t r u c t u r a lG e n e ；G e n eC l o n i n g ； E x p r e s s i o nA n a l y s i s I V 縮略詞表 縮略詞表 7 5 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人提交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。 論文中引用他人已經(jīng)發(fā)表或出版過(guò)的研究成果，文中已加了特別標(biāo)注。對(duì)本研 究及學(xué)位論文撰寫曾做出貢獻(xiàn)的老師、朋友、同仁在文中作了明確說(shuō)明并表示 衷心感謝。 學(xué)位論文作者：孫畸釷芝 簽字日期：勘p 年r 月挑日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解西南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被 查閱和借閱。本人授權(quán)西南大學(xué)研究生院( 籌) 可以將學(xué)位論文的全部或 部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手 段保存、匯編學(xué)位論文。 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書，本論文：環(huán)保密，口保密期限 至年月止) 。 學(xué)位論文作者簽名：盈鍵 導(dǎo)師簽名：辛心 簽字日期：，o 年譬月j 嚕日簽字日期：如、o 年r 月 第一章文獻(xiàn)綜述 | 奠奠皇一II 置- 第一章文獻(xiàn)綜述 葉色是蔬菜的重要品質(zhì)特性之一，葉片色澤的多樣性直接影響到蔬菜的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì) 價(jià)值，特別是近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)于高品質(zhì)蔬菜的需求與日俱增，除了常見葉色 的蔬菜之外，特別是具有新奇葉色或者花色的蔬菜，具有更廣闊的開發(fā)與利用前景。 植物葉片的顏色不是單一因素造成的，而是由于多種因子共同作用的結(jié)果，這種作用主 要是對(duì)葉片不同部位組織中不同色素的種類和含量進(jìn)行調(diào)控。相對(duì)于對(duì)花色改變的大量研究 而言，對(duì)于葉片顏色的研究相對(duì)較少，因此，對(duì)植物葉片顏色的研究可為新品種的選育帶來(lái) 新的思路，為提高蔬菜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要的意義。 1 1 類黃酮化合物的生物功能及合成途徑 植物的顏色主要是由于類黃酮( F l a v o n o i d s ) 、類胡蘿I - 素( C a r o t e n o i d s ) 和甜菜堿素 ( B e t a l a i n s ) 的不同分布決定的，這三類色素通常是植物的次生代謝產(chǎn)物，存在于細(xì)胞液泡 或質(zhì)體中，通過(guò)對(duì)太陽(yáng)光的反射，最終呈現(xiàn)出不同的色彩。其中，花青素主要使植株顯現(xiàn)出 粉紅色、紅色、紫紅色和藍(lán)色；類胡蘿卜主要影響黃色的形成；甜菜堿素引起植物呈現(xiàn)黃色、 橙黃色、紅色和紫色等色彩。除了這三類色素的分布引起的不同顏色，植物內(nèi)部或者表面結(jié) 構(gòu)等理化性狀的差異也同樣影響了植物顏色的形成1 1 - z 。 類黃酮類化合物作為植物呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色及紫色的主要因素，近年來(lái)人們對(duì)植物的次生 代謝產(chǎn)物有了更多的關(guān)注和認(rèn)識(shí)。從1 6 6 4 年R o b e nB o y l e 提出的影響植物色彩的酸堿理論到2 0 世紀(jì)末人們對(duì)類黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其調(diào)控基因的研究來(lái)看，大量關(guān)于類黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)、 化學(xué)活性及其生物合成的機(jī)理已被了解和掌握。類黃酮類化合物相對(duì)多樣種類都具有共同的 基本結(jié)構(gòu)，即從苯丙氨酸和丙二酰輔酶A ( 輔酶A 由脂肪酸合成途徑提供) 衍生而來(lái)的的芳香 環(huán)，即查爾酮。查爾酮在查爾酮異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化為黃烷酮，然后以黃烷酮為中線，通過(guò) 多條途徑轉(zhuǎn)化形成了各種類黃酮類化合物。在大多數(shù)高等植物中類黃酮類化合物主要分為查 爾酮c h a l c o n e s 、黃酮f l a v o n e s 、黃酮醇f l a v o n o l s 、黃烷酮f l a v a n d i o l s 、花青素a n t h o c y a n i n s 和縮合 單寧c o n d e n s e dt a n n i n s ( 原花色素) 六種類型；除此以外，植物非必需的橙酮a u o n a 3 也廣泛 存在于植物體內(nèi)。某些植物( 大部分豆科植物及少數(shù)非豆科植物) 還能合成一些特殊的類黃 酮類物質(zhì)，比如異黃酮。同樣在高粱S o r g h u mb 缸o(hù) l o r ，玉米Z e am a y s ，大巖桐$ i n n i n g i ac a r d i n a l i s 等植物還能合成3 脫氧花青素【5 】o 在葡萄、花生和松樹中還發(fā)現(xiàn)合成了與類黃酮十分相似的 芪類化合物。因此，類黃酮類化合物代謝途徑的多樣性是由于其代謝分化的多樣性或者是在 某些植物的進(jìn)化過(guò)程中缺失形成的。 普遍存在于植物體內(nèi)的類黃酮類物質(zhì)大約有3 0 0 0 種?；ㄇ嗨仡惿嘏c黃酮醇輔色素的一 個(gè)重要生理功能就是吸引傳粉者和種子傳播者，通常利用昆蟲傳粉的植物花瓣大多有鮮艷的 花色，而這些色彩主要是由紅紫色的花青素、黃色的橙酮和查爾酮組成，鮮艷的色彩可以吸 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 引昆蟲促進(jìn)傳粉的作用：植物中的婁黃酮類化臺(tái)物可吐吸收紫外線咀防止葉綠體光系統(tǒng)的 損壞1 7 另外?；ㄇ嗨仡惿剡€可以大量吸收波長(zhǎng)為5 3 0 h m 的光，防止葉綠體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自 由基帶來(lái)的傷害9 氣類黃酮類化合物還對(duì)花粉的萌發(fā)、減輕病蟲微生物的傷害具有重要的作 用”q ；除此以外，黃酮類化臺(tái)物也是很多藥用植物的活性成分，常見的有蘆丁、攥皮紊、葛 報(bào)素等 1 2 - 1 3 l 。 ”y “：亭 * t m 圍卜l 主要糞黃酮婁精質(zhì)生物代謝選徑 F i gl 1s c h e m a t i co ft h em a j o rb r a n c hp a t h w a y = o ff I M i db i o s y n t h e s i $ 在過(guò)去的1 5 0 年中，很多婁黃酮類化臺(tái)物還推動(dòng)了很多科學(xué)研究的發(fā)展深 比如孟德爾 對(duì)于豌豆種皮遺傳規(guī)律的研究，M c C l i n l o c k 在玉米類黃酮生物合成基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn) b 冒一 第一章文獻(xiàn)綜述 ! I II I 鼉曼曼量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼皇量曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼! ! ! 曼曼曼曼曼曼曼寰曼鼉曼曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼曼! 曼! ! 曼曼曼曼曼曼 座子等。特別是在矮牽?；ㄉ难芯恐?，花青素的分布方式促進(jìn)了共抑制現(xiàn)象的深入研究。 類黃酮類色素除了在植物顯色中具有重要的作用之外，在植物間信號(hào)傳導(dǎo)、雄性育性、對(duì)病 原微生物的抵抗以及對(duì)紫外線的防護(hù)中起到了不可或缺的作用。在對(duì)類黃酮類物質(zhì)的早期研 究中，苔蘚中的黃酮和黃酮醇起初被認(rèn)為起到化學(xué)信號(hào)分子和紫外線防護(hù)的作用。類黃酮類 化合物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)健康的潛在益處，特別是豆科食物中的異黃酮類物質(zhì)還具有一 定的抗癌作用。 近年來(lái)，大量的研究工作主要集中在分子遺傳水平上以闡明類黃酮生物合成途徑，大量 影響類黃酮合成的突變體己通過(guò)其花和種皮顏色的變化分離得到【”J4 1 。在對(duì)玉米、金魚草和 矮牽牛的研究中己分離得到了許多類黃酮合成途徑的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，擬南芥作為模式 植物的應(yīng)用更是促進(jìn)了類黃酮類化合物生物合成途徑調(diào)控與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究。在擬南芥類 黃酮生物合成研究中一個(gè)重要的觀點(diǎn)認(rèn)為編碼類黃酮代謝的關(guān)鍵酶( 黃酮醇和花青素的合成) 的基因是單拷貝基因，而黃酮醇合成酶是由六個(gè)拷貝的基因編碼，其中兩個(gè)可能并不表達(dá)I l5 1 。 擬南芥中，由于一些基因的突變，造成了種皮中色素含量減少，種皮呈現(xiàn)出透明或半透明， 這種突變體被稱為透明種皮突變體( 仃a m p a r e n tt e s t a ) 。在對(duì)這些突變體的研究中已經(jīng)確認(rèn)了 分散于基因組中大部分類黃酮生物合成途徑的調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因。目前，已經(jīng)明確功能的 刀基因已經(jīng)由最初的1 2 個(gè)上升到2 2 個(gè)。通過(guò)對(duì)仃基因的研究，黃色和棕色種皮的種子得以育 成，而這對(duì)于油菜的育種是有重要意義的；除了對(duì)種皮色澤的育種以外，刀基因還間接的影 響到降低植物種子休眠。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)也被用于分離類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵基因。 在目前對(duì)類黃酮類化合物大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因和少量調(diào)控基因的研究都是以擬南芥的特異突變體 作為模式植物。雖然擬南芥中類黃酮合成途徑可能有別于其他植物( 比如在抗性和雄性育性 方面) ，但是在擬南芥中研究類黃酮類化合物對(duì)紫外線防護(hù)和生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)理具有重要的 作用【1 “2 2 1 。 1 2 花青素的種類、功能及理化性質(zhì) 花青素是植物體內(nèi)主要的類黃酮類水溶性色素，也可溶于甲醇、乙醇和丙酮等極性溶劑 中，不溶或微溶于非極性溶劑中。花青素因可強(qiáng)烈吸收可見光而區(qū)別于其他類黃酮類化合物， 在紫外可見光譜區(qū)( 2 0 0 , 7 0 0 n t o ) ，花青素的鹽酸甲醇溶液在5 0 0 5 5 0 n m 處有其特征吸收峰【2 3 2 4 1 。 主要積累在花瓣或葉片表皮細(xì)胞的液泡內(nèi)，通過(guò)積累不同種類的花青素從而控制花色和葉色。 花青素因取代基種類和位置的不同形成了不同顏色，花青素從結(jié)構(gòu)上可以大致分為三類：天 竺葵素p e l a 唱o n i d i n 、矢車菊素c y a n i d i n 和飛燕草素d e l p h i n i d i n 。另外，從矢車菊素和飛燕草素 衍生出芍藥花色素p e o n i d i n 、錦葵素p e n m i d i n 和碧冬茄素m a l V i d i n 等花青素矧。由于花青素的吡 喃環(huán)上的氧是4 價(jià)的，具有堿性，而本身的酚基又呈現(xiàn)出酸性，因此，花青素可以和酸、堿形 成鹽。 3 兩南大學(xué)碩十學(xué)位論文 R 4 圖卜2 花青素母基團(tuán)( 2 一苯基苯并陽(yáng)離子) R 1 和R 2 取代基為H ，0 H 或O C H 3 ：R 3 取代基為糖基或H ：R 4 為0 H 或糖基 F i g 1 2T h ef I a v y Ii u mc a t i o n R 1a n d R 2a r eH O HO rO C H 3 ；R 3iSag l y c o s y Io rH ：a n dR 4isO Ho r ag ly c o s y l 【2 6 】 o C H 3 O c H 3 o H O H O c H 3 O H O C H 3 M a l v 門i n 圖1 - 3 常見六種花青素結(jié)構(gòu)幢7 1 F i g 1 3T h ec o m m o nS i Xa n t h o c y a n i n s 在花青素溶液中，花青素會(huì)隨著溶液p H 值的變化而出現(xiàn)構(gòu)象變化，在一個(gè)固定的p H 之下， 花青素出現(xiàn)四種結(jié)構(gòu)互換平衡，如圖1 3 ，非?；王；幕ㄇ嗨卦趐 H 較低時(shí)呈現(xiàn)紅色， 隨著p H 的增大，花青素紅色變淡，在p H 達(dá)到最大時(shí)變成藍(lán)紫色。但是具有兩個(gè)以上?；幕?4 早少 ，早礦艮 + 、 O r 0 籠1 第一章文獻(xiàn)綜述 青素在p H 改變過(guò)程中都表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。 表1 - 1 自然界常見的花青素 T a b 1 1N a t u r aIIyO C C U F rin ga n t h o c y a nin s 表卜2 植物中花青素的功鰣2 羽 T a b 1 - 2T h er o I eo fa n t h o c y a n i n si nD I a n t s 花青素的熱穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)、溶液酸堿性及所在體系的其他成分有關(guān)?；ㄇ嘬仗擒张浠?的羥基化導(dǎo)致花青苷的穩(wěn)定性降低，但是糖基化等修飾可以使其穩(wěn)定性得以增強(qiáng)。在圖l - 4 中 的四種構(gòu)象中，加熱會(huì)使花青素向無(wú)色查爾酮移動(dòng) 2 9 】。 光照一方面有利于花青素的生物合成，另一方面也會(huì)導(dǎo)致花青素的降解。在光照條件下， ?；幕ㄇ嗨乇确酋；ㄇ嗨馗€(wěn)定?；ㄇ嘬招纬煽s合單寧( c o n d e n s e dt a n n i n ) 后也會(huì)提 高或降低花青苷的穩(wěn)定性【3 們。 5 兩南大學(xué)碩士學(xué)1 _ 7 ：論文 R R R H K 2 H O o H R 2 + H 非 R 3 2 圖1 - 4 花青素結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化 F i g 1 - 4T h ec o n v e r s i o no fs t r u c t u r ei na n t h o c y a n i n 在花青素的呈色過(guò)程中，輔色素( c o p i g m e n t ) 也起到了極其重要的作用，在自然界中， 這些增強(qiáng)花青素著色能力的輔色素通常是由黃酮類化合物、氨基酸和某些特異的核苷酸組成。 此外，花青素本身也可作為其他花青素的輔色素。對(duì)于天然的花青苷，輔色素的呈色機(jī)理主 要是使花青苷的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，可見光吸收增強(qiáng)。輔色素在花青素成色過(guò)程 中受到很多因素的影響，其中最重要的還是p H 值的影響【3 1 j 。 1 3 花青素在食品工業(yè)上的應(yīng)用 食用色素是用于食品著色或改善食品色澤的添加劑，大致可以分為天然色素和合成色素 兩類。天然色素是從自然界動(dòng)植物組織內(nèi)提取的色素。近年來(lái)，隨著對(duì)合成色素安全性的研 究，很多對(duì)人體健康有潛在威脅的合成色素受到大量的關(guān)注，有的合成色素還具有很強(qiáng)的致 癌性，因此，許多合成色素己不能作為食品添加劑使用，這樣使得可用的合成色素?cái)?shù)量屈指 可數(shù)?；ㄇ嗨刈鳛橐环N安全的天然色素，除了具有類黃酮類化合物促進(jìn)傳粉、增強(qiáng)抗性的共 性以外，還是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的自由基清除劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)花青素具有抗氧化衰 老、抗突變、抑制癌細(xì)胞和減輕動(dòng)脈硬化的功效。因此，花青素作為食品添加劑應(yīng)用具有較 高的安全性。在一定理化條件的控制下，花青素著色自然，使用范圍較廣，同時(shí)還有一定的 保健作用。由于花青素的著色能力及其對(duì)光溫等物理?xiàng)l件的耐受力較差，加之提取成本和價(jià) 格較高，因此，花青素作為食品添加劑的推廣受到了一定的限制。但是隨著合成色素禁止使 用范圍的擴(kuò)大以及人們對(duì)食品安全性的考量，天然色素的需求現(xiàn)在逐年增長(zhǎng)【3 2 ?！盝 。總之，花 青素在園藝產(chǎn)品色澤育種、醫(yī)藥和食品添加劑等方面應(yīng)該具有一定的應(yīng)用前景和研究的價(jià)值。 6 第一章文獻(xiàn)綜述 1 4 影響花青素合成和積累的主要外在因素 1 4 1 生態(tài)因素 傳粉者的影響不同生態(tài)環(huán)境出現(xiàn)不同的花色主要是該地區(qū)最活躍的傳粉者造成的。同一 種植物在不同的地區(qū)會(huì)因?yàn)椴煌膫鞣壅叩幕顒?dòng)而表現(xiàn)出不同的色彩。同一種植物在遷移到 不同地區(qū)之后也可能發(fā)生花色或葉色的改變以適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，某些植物反應(yīng)極快，比如美國(guó) 亞利桑那州花蔥科l p o m p s i sa g g r e g a t a 的花色從紅色變成粉紅色，最后變成白色，是因?yàn)檫m應(yīng)偏 好白色的白線天蛾H y l e sl i n e a t a 其傳粉【3 6 1 。 真菌侵染和機(jī)械損傷這兩種刺激可以誘導(dǎo)某些植物查爾酮合成酶的表達(dá)，最終提高類黃 酮類化合物的含量，以達(dá)到抗病的目的【3 7 4 2 1 。 1 4 2 物理因素 光照光強(qiáng)、光質(zhì)和光周期直接影響到花青素合成和積累。弱光使花青素的合成漸弱，充 足的光照強(qiáng)度促使固有花色的形成，但是過(guò)于強(qiáng)烈的光照也會(huì)破壞花青素的穩(wěn)定性。光通過(guò) 光合作用為花青素的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并調(diào)節(jié)花青營(yíng)生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性。類黃 酮的合成也只有在光下才能正常進(jìn)行。各種光都可以促使花青素的合成，但是藍(lán)光和紅光最 有效，綠光的效果最差，并且綠光還可能導(dǎo)致葉綠體產(chǎn)生大量自由基損壞光合系統(tǒng)。紫外光 也參與了矮牽牛P A L 和a 器基因的表達(dá)1 4 3 4 9 】。 溫度低溫誘導(dǎo)花青素的合成是植物抵御低溫的主動(dòng)保護(hù)機(jī)制。花青素的生物合成與抗凍 性具有一致性，在對(duì)幾種低溫敏感的擬南芥突變體的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下，這些突變體 均不能形成花青苷。許多植物在秋季溫度降低之后產(chǎn)生大量花青素，隨著溫度進(jìn)一步降低， 植物中可溶性糖含量增加，花青素糖基化水平提高，形成更加穩(wěn)定的花青苷，以抵抗冬季低 溫傷害。植物液泡中大量匯集的可溶性有機(jī)物質(zhì)可以降低水勢(shì)，使冰點(diǎn)降低，防止低溫條件 下冰晶的形成，特別是表皮細(xì)胞中積累的花青苷可以防止表皮細(xì)胞受到損傷，從而保護(hù)落葉 植物免收霜凍的傷害【5 0 5 2 1 。 水分滲透脅迫可以誘導(dǎo)花青素的生成，含有花青素的植物組織能夠抵抗干旱脅迫。研究 發(fā)現(xiàn)紫胡椒比綠胡椒更能耐受滲透脅迫；干旱復(fù)蘇植物在脫水期間比水分充足時(shí)多積累3 - 4 倍 的花青素，最終顯現(xiàn)出極強(qiáng)的脫水能力。干旱條件下，花青素大量積累，提高抗旱能力，同 時(shí)有助于削弱U V - B 對(duì)植物的損傷。干旱能導(dǎo)致植物缺磷，磷元素的缺乏也會(huì)造成花青素的積 累，因此在缺磷植株的莖表皮都有紫色的花青素積累?；ㄇ嗨卦谥参锉砥さ姆e累，能改變細(xì) 胞水勢(shì)，從而調(diào)節(jié)蒸騰作用，最終提到植物的抗旱能力【5 3 铘】。 1 4 3 化學(xué)因素 影響花青素合成和積累的化學(xué)因素主要有礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和糖類的影響。礦質(zhì)離子主要通過(guò)與 7 西南大學(xué)碩十學(xué)位論文 特定的花青素發(fā)生螯合而改變植物顏色；另外，光質(zhì)離子也通過(guò)影響花青素的代謝而改變花 色。糖類是花青苷的組成成分之一，也是調(diào)控花青苷合成的重要信號(hào)分子【5 7 柳】，植物液泡中 蔗糖的含量決定了花青苷的總量【6 8 1 。 1 5 花青素生物合成途徑及其相關(guān)研究 花青素代謝是類黃酮代謝途徑的一個(gè)重要分支，目前其調(diào)控機(jī)理已經(jīng)有了較為全面的研 究?；ㄇ嗨厥窃诩?xì)胞質(zhì)中從苯丙氨酸開始經(jīng)一系列的酶促反應(yīng)合成，經(jīng)不同的羥基化、糖基 化、甲基化和?；男揎椇蟊晦D(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，通常分布于花瓣和葉片的表皮細(xì)胞內(nèi)。植物 體內(nèi)的酶是基因轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物。根據(jù)是否有轉(zhuǎn)錄功能，可把基因分為三類：第一類是編碼 蛋白質(zhì)的基因，這類基因具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，包括編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)基因，以及編 碼阻遏蛋白的調(diào)節(jié)基因；第二類只有轉(zhuǎn)錄功能而沒有翻譯功能的轉(zhuǎn)運(yùn)R N A 基因和核蛋白體基 因；第三類是不轉(zhuǎn)錄的基因，這類基因?qū)虮磉_(dá)起調(diào)節(jié)控制的作用，包括啟動(dòng)基因和操縱 基因【6 9 】。 近年來(lái)對(duì)于植物花青素合成途徑及其生理生化機(jī)制已有較為深入的研究，參與花青素生 物合成的關(guān)鍵酶和相關(guān)基因都已分離和克隆，一些花青素生物合成下游基因的轉(zhuǎn)錄因子也得 到了大量的研究p 0 7 2 1 。 花青素合成的酶促反應(yīng)中幾乎所有基因都有較深入的研究，這些基因大致可以分為兩類， 第一類是植物共同具有的結(jié)構(gòu)基因，直接編碼花青素生物合成途徑中生物合成酶類；第二類 是調(diào)控結(jié)構(gòu)基因活性、色素空間時(shí)間積累的調(diào)節(jié)基因。根據(jù)基因在合成途徑中的位置，又可 將結(jié)構(gòu)基因分為上游基因( P A L 、C H S 、C H I 、乃斫u F 3H ) 下游基因( D F R 、刎曬和U F G T ) 。 1 5 1 結(jié)構(gòu)基因 結(jié)構(gòu)基因是指不同植物共同具有的直接編碼花青素代謝途徑關(guān)鍵酶的基因?，F(xiàn)在利用轉(zhuǎn) 座子標(biāo)簽、消減雜交等方法，在矮牽牛等模式植物上以克隆出了多個(gè)與花青素生物合成相關(guān) 的結(jié)構(gòu)基因，如圖1 5 所示，從合成起點(diǎn)開始主要有P A L 、C H S 、C H I , F 3 H 、F 3 曰、D F R 、A N S 、 啪礴。 苯丙氨酸解氨酶( 以L ) 苯丙氨酸解氨酶是次生代謝途徑中研究較多的酶。在類黃酮類化合物合成途徑中它催化 苯丙氨酸形成肉桂酸，進(jìn)而在查爾酮異構(gòu)酶的催化下與丙二酰C o A 形成查爾酮。在某些植物中 以單拷貝基因存在，在另一些植物中以多拷貝形式存在。P A L 的可通過(guò)逆境誘導(dǎo)，比如菜豆中 鰣工l 和g P A L 2 都能被真菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)。在對(duì)g T A Z , 2 的轉(zhuǎn)基因研究表明卿工2 僅在花瓣粉紅區(qū)域 內(nèi)表達(dá)【7 4 1 。除了花青素的形成需要朋上的催化，木質(zhì)素的形成也是有P A L 催化的反應(yīng)開始的。 在對(duì)植物次生代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，P A L 代謝途徑是大多數(shù)次生代謝所共有的。 8 第一章文獻(xiàn)綜述 查爾酮合成酶( 刪S ) C H S 是花青素生物合成途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶，最早是在P e t r o s e l i u mh o r t e n s e 中分離得到 7 5 - 7 6 。其功能主要是催化上游4 香豆酰C o A 與丙二酰C o A 形成查爾酮，形成的查爾酮提供了類 黃酮的基本骨架構(gòu)成。因此，刪S 是類黃酮類化合物的合成關(guān)鍵酶之一，在C j 峪催化下產(chǎn)生的 查爾酮可被查爾酮異構(gòu)酶( C H l ) 催化形成黃烷酮，在沒有c J W 的條件下則會(huì)產(chǎn)生外消旋黃烷酮。 不同物種間a w 基因具有較高的同源性，通過(guò)構(gòu)建C J 弼基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示他們可能有著共同 的起源。但是不同植物d W 基因在功能上存在著明顯的差異，其在不同品系之間活性也有所不 同。在對(duì)C H S 啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析研究發(fā)現(xiàn)一些反式作用元件，比如光反應(yīng)元件H 框和G 框。 由于這些反式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用決定了C 聰因?qū)Νh(huán)境因素反應(yīng)過(guò)程中的 復(fù)雜表達(dá)方式。C 月S 的表達(dá)可以被真菌、機(jī)械損傷和紫外光誘導(dǎo)【7 7 1 。在a 囂基因轉(zhuǎn)矮牽牛植株 中，某些轉(zhuǎn)基因植株的外源基因與內(nèi)源基因一起發(fā)生了共抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致花色產(chǎn)生雜色或白 色，并沒有預(yù)想中色彩的增強(qiáng)效果【7 8 】。 查爾酮異構(gòu)酶( r ) 化查爾酮形成黃烷酮，是類黃酮代謝途徑中生成的第一個(gè)類黃酮產(chǎn)物。瞅有不 同的底