維生素類藥物的分析 (4)

第五章 維生素類藥物的分析 The Analysis of Vitamines,維生素是維持人體正常生理機(jī)能所必需的生物活性物質(zhì)。 如果人體缺少某種維生素，就會(huì)引起維生素缺乏癥，而影響人體的正常生理機(jī)能。 例如: VA 缺乏夜盲癥 VB1缺乏腳氣病,概 述,脂溶性： 水溶性：,按溶解性分類,VA、VD、VE、VK等,B族（VB1、VB2等）、 VC 、煙酸、葉酸、泛酸等,第一節(jié) 維生素A的分析,一結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1 化學(xué)結(jié)構(gòu),R=H VA醇 VA1 R= COCH3 VA醋酸酯 R= COC15H31 VA棕櫚酸酯,（1）環(huán)己烯+共軛多烯側(cè)鏈； （2）天然VA側(cè)鏈為全反式； （3）天然來源主要是魚肝油，為醋 酸酯，棕櫚酸酯等,目前多由人 工合成。,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,a. 紫外吸收 具有共軛多烯側(cè)鏈紫外吸收。 最大吸收波長在325328nm，隨VA存在狀態(tài)以及所用的溶劑，最大吸收波長的位置有所不同,2 .性質(zhì), 不溶于水 溶于乙醚，氯仿，異丙醇，環(huán)己烷，脂肪和油。,b.溶解性：,共軛多烯側(cè)鏈性質(zhì)非?；顫?,c. 不穩(wěn)定性,維生素A的氧化產(chǎn)物：,環(huán)氧化物, 維生素A醛, 維生素A酸,or, 鑒別 含量測定,d.與SbCl3作用 Carr-Price反應(yīng),無水,二. 鑒別試驗(yàn) 1. 三氯化銻反應(yīng),無水,2. 紫外吸收光譜 VA的無水乙醇溶液在326nm有最 大吸收。,確認(rèn)醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯， 例：VA和其標(biāo)準(zhǔn)品用環(huán)己烷溶解 展開劑：環(huán)己烷乙醚（80：20） 板：硅膠G 顯色：SbCl3T.S. Rf： VA 醇 0.08 VA 醋酸酯 0.41 VA棕櫚酸酯 0.75,3、TLC：,三含量測定,1.概述 共軛多烯的結(jié)構(gòu)具有特征的紫外吸收。 相關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似,維生素A最大吸收 波長附近也有吸收，對(duì)測定有影響。 Morton和Stubbs等人提出了三點(diǎn)校正法。,紫外分光光度法三點(diǎn)校正法,2. 原理（根據(jù)、假定）,物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性，即,維生素A中的不相關(guān)吸收在 310340nm范圍內(nèi)近似一條直線。,效價(jià)為維生素A1的40%，max345350nm,3. 相關(guān)物質(zhì)的吸收,a. 維生素A的衍生物,維生素A2 去氫維生素A,效價(jià)低于維生素A1，max385390nm, b. 維生素A的氧化產(chǎn)物 已介紹。,維生素A3 去水維生素A, c. 合成時(shí)的中間體,側(cè)連有4個(gè)雙鍵應(yīng)有 種異構(gòu)體。 目前，包括維生素A在內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)有 6種異 構(gòu)體。它們是：, e. 維生素A異構(gòu)體, d. 鯨醇 維生素A醇的二聚體，沒有生物活性,新維生素Aa,新維生素Ab,新維生素Ac,異維生素Aa,異維生素Ab,維生素A,1：維生素A的max 2、3：分別在1兩側(cè),4. 三個(gè)波長的選擇方法,等波長差法：,1=328nm; 2 =316nm; 3=340nm,這兩個(gè)波長分別在1兩側(cè)12nm處，即,等吸光度法：,1=325nm; 2 =310nm; 3=334nm,VA在這兩個(gè)波長下的吸光度應(yīng)該等于1下 的吸光度的 ，即,5. 方法,Chp收載有2種方法。,第一法（適用于酯式維生素A的測定）,a. 操作方法,最大吸收波長確認(rèn) max 在326329nm，第一法測定。 max不在326329nm，第二法測定。,b. 計(jì)算方法,計(jì)算吸收度比及比值差,首先要計(jì)算吸收度比值 。,然后計(jì)算吸收度的比值差。,計(jì)算校正吸收度,吸收度校正公式：,換算因數(shù),定義：每一個(gè) 數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r(jià)。,1IU=0.344g全反式維生素A醋酸酯， 1g的維生素A醋酸酯就相當(dāng)于,維生素A醋酸酯,練習(xí)題：維生素AD膠丸中維生素A的含量測定 已知：平均膠丸重為0.0815g 維生素A的標(biāo)示量為10000IU/丸 取樣：,求：維生素A的標(biāo)示百分含量。,測定數(shù)據(jù)如下表,首先要求樣品的 。,根據(jù)比爾定律,A為測得吸收度or校正吸收度,首先計(jì)算吸收度比值和吸收度比值差。（填于上表）,由此可知，應(yīng)該用測得的328nm處的吸收度計(jì)算。,然后計(jì)算校正吸收度與未校正吸收度相差的百分?jǐn)?shù),由結(jié)果知，需計(jì)算校正吸收度。,所以，維生素A的標(biāo)示含量,這樣,第二法（皂化法）： 消除植物油干擾：適合VA醇,b.在300，310，325和334nm處測定吸收度，找出max c.計(jì)算 d.校正公式 A325（校）=6.815A325-2.555A310- 4.260A334 e. 判斷,5、注意事項(xiàng) （1）VA遇光易氧化變質(zhì)，操作應(yīng)半暗室 中快速進(jìn)行，所用試劑不得含氧化性物 質(zhì)，以防VA紫外線或氧化性物質(zhì)破壞。,（2）用三校正法測定時(shí)，一點(diǎn)在max處，其余兩點(diǎn)均為吸收曲線的上升和下降陡坡處。對(duì)波長的正確性要求嚴(yán)格。340nm處，若波長誤差0.5nm，可影響結(jié)果-3.12.07%。所以測定時(shí)所用儀器的波長讀數(shù)應(yīng)注意，必要時(shí)應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)。,維生素A醋酸酯膠丸含量測定:取內(nèi)容物39.1 mg,加環(huán) 己烷溶解并稀釋成100ml，在下列五個(gè)波長處測得吸 收度A值如下：,已知：平均膠丸內(nèi)容物重為0.08736g;維生素A的標(biāo)示量為3000 IU/丸 試求：維生素A的標(biāo)示百分含量？,維生素A醋酸酯膠丸的含量測定，取內(nèi)容物W，加環(huán)己烷溶解并稀釋至10ml，搖勻，精密量取0.1ml,再加環(huán)己烷稀釋至10ml ，使其濃度為915IU/ml。已知內(nèi)容物平均重量為80.0mg,每丸標(biāo)示量為10000IU。試計(jì)算取樣量（ W ）的范圍是多少？,第二節(jié) 維生素E的分析,名稱：消旋生育酚醋酸酯 母核：苯駢二氫吡喃衍生物 苯環(huán)上有一乙?；姆恿u基 側(cè)鏈：脂肪烷烴,一化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),二、鑒別試驗(yàn) 1、硝酸反應(yīng)： 本品，無水乙醇溶解，加硝酸，75加熱約15分鐘，顯橙紅色。 2、水解后氧化反應(yīng)： 本品，在堿性條件下水解，得生育酚，在聯(lián)吡啶和三氯化鐵試液的作用下，反應(yīng)產(chǎn)生血紅色配離子。,3、UV吸收： VE的0.01%無水乙醇液： max=284nm min=254nm,三、雜質(zhì)檢查 檢查游離生育酚: ChP2000 P798 取0.1g樣品，按鈰量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定，以二苯胺為 指示劑，消耗Ce(SO4)2液不得超過1.0ml。,（一）鈰量法 1、原理： VE用硫酸加熱回流，水解成生育酚，用硫酸鈰定量地氧化為對(duì)一生育醌，過量的硫酸鈰氧化二苯胺指示劑而指示滴定終點(diǎn)。 終點(diǎn)：亮黃灰紫 空白試驗(yàn),四、含量測定,2、反應(yīng)條件 （1）VE在H2SO4酸性條件下水解為宜。 堿性溶液中游離生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中進(jìn)行,如在堿性中會(huì)生成堿式鹽而影響測定。,（2）Ce(SO4)2溶于酸水溶液，不溶于醇,生育酚溶于酸而不溶于水, 滴定過程中應(yīng)有一定濃度的乙醇。 （3）本法適用于純度高的VE供試品。,（二）氣相色譜法：Chp2000 1、色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：2m4mmI.D.硼硅玻璃柱， 內(nèi)裝硅藻土（80100目） 固定相：硅酮（OV-17） 涂布濃度 2% 載氣：N2， 流速:含2%固定相：以1820分鐘為宜； 含5%固定相：以3032分鐘為宜,柱溫：265 內(nèi)標(biāo)：正三十二烷 檢測器：FID（氫火焰離子化檢測器） 性能要求： 理論塔板數(shù)按VE峰計(jì)算應(yīng)不低于500， VE峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2。,2、溶液配制： 內(nèi)標(biāo)溶液：正三十二烷的環(huán)己烷溶液 （1.0mg/ml） 對(duì)照溶液：對(duì)照品溶解于內(nèi)標(biāo)溶液中 (1mg/ml) 供試品溶液：供試品約50mg，用內(nèi)標(biāo)溶液，溶解并稀釋至50ml,4、供試品測定 mg=FAxMs/As Ax ：供試品峰面積 F：校正因子 As ： 內(nèi)標(biāo)物的峰面積 5、特點(diǎn)： （1）簡便快速、專屬性強(qiáng)，適用于VE、VE制劑及多種維生素制劑中VE的測定。 （2）需要特殊儀器,（三）高效液相色譜法 日本藥局方（JP13） 色譜條件： 柱：ODS 流動(dòng)相：甲醇水(49:1) 檢測波長：292nm 對(duì)照品法定量,第三節(jié) 維生素B1的分析,一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1.結(jié)構(gòu)：,氯化3-（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基-5-（2-羥乙基）-4-甲基噻唑的鹽酸鹽,2. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： a.氨基嘧啶次甲基噻唑環(huán)季銨化合物 b.堿性基團(tuán)： 嘧啶環(huán)上的氨基 可與酸成鹽 噻唑環(huán)上的季銨,3. 性質(zhì)： 硫色素反應(yīng) VB1噻唑環(huán)在堿性條件下可被鐵氰化鉀K3Fe(CN)6等一些氧化劑氧化后，與嘧啶環(huán)上的氨基縮合成具有熒光的硫色素。, 沉淀反應(yīng) VB1的含氮雜環(huán)，能和生物堿沉淀試劑反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。 如：VB1與硅鎢酸反應(yīng)可生成組成一定的沉淀。 重量法測定VB1含量。, 硫胺顯堿性 具有兩個(gè)堿性基團(tuán): 噻唑環(huán)上的季銨 嘧啶環(huán)上的氨基 可以和酸成鹽。 如：鹽酸硫胺、硝酸硫胺。, 加堿分解后與醋酸鉛反應(yīng) VB1與NaOH試液一起加熱，分解產(chǎn)生NaS，可與PbAc2反應(yīng)生成PbS的黑色沉淀。 維生素B1的水溶液顯氯化物的特征反應(yīng)。,二. 鑒別試驗(yàn),1. 硫色素?zé)晒夥磻?yīng),VB1專屬反應(yīng)，用于鑒別和含量測定。,2、沉淀反應(yīng)： 可與某些生物堿沉淀試劑生成組成恒定的 沉淀 如：與碘化汞鉀產(chǎn)生淡黃色沉淀 與碘生成紅色沉淀 與硅鎢酸生成白色沉淀 與苦味酸生成扇形白色結(jié)晶,三. 含量測定 非水滴定法（ChP所用方法） 硅鎢酸重量法 銀量法 硫色素?zé)晒夥?紫外分光光度法 比色法 絡(luò)合滴定法,（一）非水溶液滴定法： 1、原理： VB1分子中含有已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán)，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可被高氯酸滴定。,2、方法： 溶劑：冰醋酸 指示劑：喹哪定紅- 亞甲藍(lán)混合指示液 滴定劑：高氯酸 醋酸汞： 終點(diǎn)：天藍(lán)色 空白校正： T=16.86mg/ml,（二）硅鎢酸重量法,2VB1硅鎢酸,白色沉淀4HCl,1、原理： VB1在酸性溶液中與硅鎢酸作用 產(chǎn)生沉淀，根據(jù)沉淀的重量和供試品 的重量即可計(jì)算其含量。,2、計(jì)算： 2VB1的分子量為2337.27 沉淀的分子量為3479.22 換算因數(shù)=0.1939 （含義：1g沉淀相當(dāng)于0.1939gVB1）,3、測定方法：,4、實(shí)驗(yàn)條件 （1）取樣量： 應(yīng)在50mg左右，不得少于25mg。 （2）加入鹽酸的目的：易于過濾。 酸量不足：沉淀的顆粒過細(xì)。 酸量過多：無太大影響。,（3）硅鎢酸的用量： 硅鎢酸：VB1= 8：1 用量不足，導(dǎo)致結(jié)果偏低 （4）干燥溫度： 80，干燥3hr，至恒重，沉淀含4分子結(jié)晶水，換算因數(shù)為0.1939,（5）硅鎢酸的加入速度 用滴管一滴一滴加入，純度高快加，純度低慢加。 防止沉淀表面吸附的雜質(zhì)來不及離開而被沉淀包圍。 （6）煮沸時(shí)間 25min為宜 使沉淀顆粒大，利于過濾洗滌。,（7）沉淀的洗滌 用熱稀鹽酸洗滌，洗滌液用量不得多于50ml，否則，沉淀會(huì)部分溶解 （8）洗器 用4號(hào)垂熔玻璃漏斗為宜。,4、重量法特點(diǎn) （1）比較準(zhǔn)確、靈敏； （2）方法簡便，不需要特殊儀器； （3）恒重比較費(fèi)時(shí)間。,第四章 維生素C的分析 一. 化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 維生素C分子中具有2個(gè)手性C原子，具有4種光學(xué)異構(gòu)體。其中生理活性最強(qiáng)的是L（+）-抗壞血酸,D(-)-異抗壞血酸,L(+)-異抗壞血酸,L(+)-抗壞血酸,D(-)-抗壞血酸, 具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。 堿性下可水解。 具有烯二醇基。 還原性，能夠被氧化成去氫抗 壞血酸。 酸性,能與堿成鹽。,二性質(zhì)與鑒別試驗(yàn) 1. 酸性 烯二醇結(jié)構(gòu)酸性。 C3-OH， pKa=4.17(共軛效應(yīng)) C2-OH，pKa=11.57(鄰位羰基) 一元酸. 能與NaHCO3作用生成鈉鹽。,2.還原性 烯二醇基還原性。 如：,3. 水解反應(yīng),L-二酮古羅糖酸 (無生物活性),4. 熒光反應(yīng),5. 糖的性質(zhì) VC的結(jié)構(gòu)很象糖結(jié)構(gòu)，具有糖的性質(zhì)。,這個(gè)反應(yīng)的摩爾比是12。,三含量測定,1. 碘量法,a. 原理,b. 操作,終點(diǎn)顏色：無色藍(lán)色 1ml 0.