免疫組織化學(xué).ppt

免 疫 組 織 化 學(xué) Immunohistochemistry (IHC),第一章 免疫組織化學(xué)基本原理 及相關(guān)知識,用標記的抗體（或抗原）對細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過組織化學(xué)的顯色反應(yīng)之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電鏡觀察。,蛋白質(zhì) 磷脂 多肽 多糖 核酸 受體 酶 病原體 激素,免疫組織化學(xué)技術(shù)的突出優(yōu)點： 高度的特異性 敏感性高 方法步驟統(tǒng)一 機能和代謝密切結(jié)合， 定性、定位、定量的統(tǒng)一,免疫組織化學(xué)技術(shù)在細胞、染色體或亞細胞水平原位檢測抗原分子，是其它任何生物技術(shù)難以達到和代替的。它能在細胞、基因和分子水平同時原位顯示基因及其表達產(chǎn)物，形成了新的檢測系統(tǒng)，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和各個領(lǐng)域分子水平的研究與診斷，開拓了廣闊的前景。, 基因探針 核酸分子雜交技術(shù) 原位PCR技術(shù) 核酸雜交和免疫組織化學(xué)雙標記 電鏡雜交技術(shù),核酸分子探針-雜交-免疫組織化學(xué) 放大和顯示雜交信號 雜交免疫組織化學(xué),基因重組技術(shù) 免疫組織化學(xué) 圖像分析 單抗技術(shù) 技 術(shù) 流式細胞術(shù) 激光共聚焦顯微術(shù),免疫組織化學(xué)的全過程： 抗原的提取和純化 免疫動物或細胞融合（單克隆抗體） 抗體效價檢測和提取、純化 標記抗體 細胞、組織切片標本的制備 免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色 觀察和記錄結(jié)果,第二章 免疫組織化學(xué)中的技術(shù)問題,技術(shù)問題的重要性,第一節(jié) 有關(guān)的細胞和組織學(xué)技術(shù),一、取材 （一）細胞標本的取材 印片法 穿刺吸取涂片法 體液沉淀涂片法 細胞數(shù)量多：直接涂片 細胞數(shù)量少：離心沉淀涂片, 培養(yǎng)細胞 直接收集 培養(yǎng)液離心涂片,（二）組織標本的取材 活檢鉗的刀口必須鋒利，以免組織受擠壓 取材部位必須是主要病變區(qū) 必須取病灶與正常組織交界處 必要時取遠離病灶區(qū)的正常組織作對照,新鮮組織 冰凍切片 液氮保存 -70冰箱,二、固定 固定劑：常用醛類固定劑 10%福爾馬林（甲醛10ml + 蒸餾水90ml） 10%中性緩沖福爾馬林（甲醛10ml + 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml ） 2.5%戊二醛 用于電鏡 丙酮 用于冰凍切片、細胞涂片 4,固定方法： 浸入法 灌注法,三、切片 1. 石蠟切片 2. 冰凍切片 3. 塑料切片 4. 超薄切片,四. 玻片處理和涂膠 載玻片和蓋玻片處理 蓋玻片、載玻片 清潔液中浸泡24h（硫酸 + 重鉻酸鉀） 清水沖洗 蒸餾水沖洗 95%酒精浸泡24h 烘干,載玻片涂粘附劑: APES 多聚賴氨酸,第二節(jié) 免疫組化染色中的技術(shù)問題,一、抗體 新制備或購進的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清或腹水。,1. 抗體貯存 2. 抗體稀釋 按不同的免疫染色方法和抗原性強弱及抗原的多少，稀釋各種抗體原液，以便獲得最佳免疫染色效果。, 抗體最佳稀釋度的測定方法 二抗 一 抗 1 1:50 1:100 1:200 1:400 _ 1:50 + + + 1:100 + + + 1:200 + + 1:400 _, 以中等陽性稀釋度為佳 抗體稀釋液的配制 0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS,3抗體的選擇 (1) 多抗：雖然存在交叉反應(yīng)的問題，但由于識別多個抗原表位，所以即使有少數(shù)幾個抗原表位被破壞，仍然不會影響實驗結(jié)果，這是多抗的優(yōu)點之一。 (2) 單抗：識別單個抗原表位，所以特異性高。但如果所識別的抗原表位被破壞，則會影響實驗結(jié)果，這也是單抗的缺點之一。,多抗？單抗？ 抗原表位的豐富程度 也可應(yīng)用多個單抗 （a cocktail of monoclonal antibodies）解決抗原表位少的問題,二、免疫染色 一般程序： 標記抗體與標本中的抗原反應(yīng)結(jié)合 用PBS洗去未結(jié)合的部分 直接觀察結(jié)果（免疫熒光）或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶）,1. 增強特異性染色的方法 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 合適的抗體稀釋度 第一抗體 溫育時間 37 30-60 min, 4 過夜 多層染色法（雙層、三層）,2. 減少或消除非特異性染色的方法 加二抗動物的正常血清 2%5%牛血清白蛋白,3. 顯色反應(yīng)的控制 顯色劑的濃度、溫育時間 4. 復(fù)染,三、對照 陽性對照 陰性對照 阻斷試驗 替代對照 空白對照 自身對照 吸收試驗,四、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷 陽性細胞染色分布有三種類型：胞漿、胞核、細胞膜表面, 陽性細胞分布可分為灶性或彌漫性 由于細胞內(nèi)抗原含量不同，所以染色強度不一, 陽性細胞染色定位于細胞，與陰性細胞相互交雜分布。 切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域 、壞死或擠壓的細胞區(qū)、膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。,第三章 免疫組織化學(xué)常用方法介紹,第一節(jié) 免疫酶細胞化學(xué),免疫酶細胞化學(xué)是免疫組織化學(xué)中最常用的方法，它是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶細胞化學(xué)手段，檢測某種物質(zhì)（抗原抗體）在組織細胞內(nèi)的存在部位。即預(yù)先將抗體與酶連結(jié)（酶標抗體），再使其與組織內(nèi)特異性抗原反應(yīng)，經(jīng)細胞化學(xué)染色后，在光鏡或電鏡下觀察分析。,一、常用酶的種類 用于標記的酶應(yīng)具備以下幾點： 酶催化的的底物必須是特異性的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。 所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，不向周圍組織彌散。 較易獲得酶分子，最好有商品出售。, 中性pH時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標記抗體后，保存12年活性不應(yīng)改變。 酶標過程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性。 被檢測組織中，不應(yīng)存在與標記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。,免疫組織化學(xué)常用酶 名稱 分子量 內(nèi)源性 商品 HRP (POD) 40-50 kD + 有 ALP (AP) 80-120 kD + 有 , HRP/POD（辣根過氧化物酶） 顯色原理： HRP + H2O2 HRP H2O2 + 供氫體 （電子供體） HRP + H2O + 供氫體 （氧化型）,DAB（二氫基聯(lián)苯胺） 棕褐色 AEC（3-氫-9-乙基咔唑） 紅色 TMB（四甲基聯(lián)苯氨） 深藍色, ALP/AP（堿性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 發(fā)色團：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT,血細胞、淋巴細胞 內(nèi)源性過氧化酶含量較高 可選用ALP/AP,二、染色步驟及原理 間接法： 1. 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，下行酒精至水; 2. 未固定的冰凍切片，丙酮固定 2030 min，風(fēng)干1530min;,3. 用0.03%H2O2處理切片1530 min(室溫)，封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性； 4. PBS洗滌2min; 5. 0.05% Tween-20/PBS，5min（室溫）；,6. 0.1%-1% BSA濕盒內(nèi)孵育1525 min（室溫），然后輕輕棄去孵育液（不沖洗） ；(或二抗動物的正常血清); 7. 輕輕棄去孵育液，滴加PBS稀釋的第一抗體，濕盒內(nèi)孵育12 h （20-25）； 8. PBS充分沖洗， 5min 3次，以去除切片上非特異性吸附的抗體；,9. 滴加PBS稀釋的HRP標記的第二抗體，濕盒內(nèi)孵育4560 min （室溫）； 10. PBS漂洗 5min 3 次； 11. 顯色，0.01% - 0.1% H2O2 0.01% -0.05% DAB, 1015 min； 12. 細胞核復(fù)染（甲基綠或蘇木素）； 13. 封片、觀察、記錄。,親和組織化學(xué)（affinity histochemistry） 植物凝集素與糖類 生物素與抗生物素 葡萄球菌A蛋白與IgG 陽離子與陰離子 激素、維生素、糖類與受體,第二節(jié) 抗生物素-生物素免疫細胞化學(xué)染色法,一、基本原理 抗生物素（卵白素） avidin 分子量68 000 糖蛋白 生 物 素 （維生素H） biotin 分子量 244,biotin,avidin,biotin,biotin,biotin,二、抗生物素-生物素-過氧化酶復(fù)合物技術(shù) (Avidin-Biotin-peroxidase Complex technique, ABC法) 其特點是利用抗生物素分別連接生物素標記的第二抗體和生物素標記的酶。,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC complex,操作步驟： 1. 石蠟切片脫蠟，系列酒精至水； 2. 冰凍切片丙酮固定10min，PBS洗滌5min 3；,2. 第一抗體，室溫孵育60 min ； 3. PBS洗滌 5 min 3次 4. 生物素標記的第二抗體，孵育45 min 5. PBS洗滌 5 min 3次,6. ABC復(fù)合物， 45 min 7. PBS洗滌 5 min 3次 顯色（H2O2/DAB）、復(fù)染、封片 觀察、記錄,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC復(fù)合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10g/ml biotin 2.5g/ml 臨用前30分鐘配制,ABC法特點： 敏感性強，具有放大作用 特異性強，背景染色淡 方法簡便，節(jié)約時間 由于生物素與抗生物素具有與多種示 蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重染色,注意事項 內(nèi)源性生物素活性及其消除：肝、腎、白細胞、乳腺預(yù)先以0.01%抗生物素和0.01%生物素溶液分別作用20 min，以消除內(nèi)源性生物素。 試劑的差異，應(yīng)進行預(yù)實驗。 ABC試劑盒保存以4為佳。,第三節(jié) 葡萄球菌蛋白A（SPA）,葡萄球菌蛋白A（ staphylococal protein, SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)。 早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)某些金黃色葡萄球中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀，1959年將其命名為A抗原。,一、免疫學(xué)特性 SPA具有與人及多種動物（豚鼠、豬、小鼠、猴等）IgG結(jié)合的能力。SPA結(jié)合部位是Fc段而不是Fab段，這種結(jié)合不會影響抗體的活性。SPA具有的結(jié)合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結(jié)合兩個IgG分子，也可一方面同IgG結(jié)合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金、鐵蛋白等相結(jié)合。,SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如 SPA 與人 IgG 亞型IgG1 、IgG2 、IgG4 有結(jié)合力，與IgG3沒有結(jié)合力。,二、SPA在免疫組化中的作用 可作為二抗或標記抗體。SPA的最大優(yōu)點是不受種屬特異性的限制，還具有染色時間短、靈敏性高和背景染色淡等優(yōu)點。,SPA-膠體金技術(shù)（PGA技術(shù)）可在電鏡水平檢查抗原抗體反應(yīng)的定位，是一種較為理想的免疫電鏡技術(shù)。,SPA-HRP用于間接法的操作步驟： 切片脫蠟 第一抗體，37，孵育30min或4，2448 h PBS 沖洗， 5min 3次 SPA-HRP（1:100 1:400）， 30 min DAB-H2O2顯色 復(fù)染、封片、觀察、記錄,第四節(jié) 凝集素,凝集素（lectin）是指一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，因其能凝集紅細胞（含血型物質(zhì)），故名凝集素。,植物凝集素 刀豆蛋白A （ConA） 麥胚素 （WGA） 花生凝集素 （PNA） 大豆凝集素 （SBA）,一、基本原理 生物膜中含有一定量的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特點在于它們能識別糖蛋白或糖脂，特別是細胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細胞膜表面的碳水化合物決定簇。一種凝集素具有對某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。因此，凝集素可以作為一種探針來研究細胞膜上特定的糖基。,麥芽素 N-乙酰糖胺 菜豆凝集素 N-乙酰乳糖胺 刀豆素 -D-吡喃糖基甘露糖,凝集素具有多價結(jié)合的能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物質(zhì)結(jié)合。,二、操作程序 直接法：標記物直接標記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素標記物（100 g/ml），室溫，30min； 3. 熒光素標記物，封片用熒光顯微鏡觀察； 4. PBS洗滌，5min 3次； 5. 顯色、封片、觀察、記錄。, 間接法：將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將示蹤物質(zhì)標記在抗凝集素抗體上。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素稀釋液（10 g/ml），室溫，30min； 3. PBS洗滌，5min 3次； 4. 標記的抗凝集素抗體（1:100），孵育30min； 5. PBS洗滌，5min 3次； 6. 顯色、封片、觀察、記錄。, 糖-凝集素-糖法：過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，再與有過氧化物酶標記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個三明治樣的糖基-凝集素-糖基的結(jié)合物。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素稀釋液（10 g/ml），室溫，30min； 3. PBS洗滌，5min 3次； 4. HRP標記糖基（10 g/ml），孵育30min； 5. PBS洗滌，5min 3次； 6. 顯色、封片、觀察、記錄。,三、應(yīng)用 作為細胞分化和成熟的標記 淋巴細胞的分群 小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)不成熟的T淋巴細胞呈PNA陽性反應(yīng)，在小鼠小腸集合淋巴小結(jié)的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽性反應(yīng)細胞，后者是否屬于不成熟的 T 淋巴細胞，值得進一步研究。, 作為細胞特殊類型的標記 研究人視網(wǎng)膜，PNA標記視錐細胞而不標記視桿細胞。 乳腺上皮細胞呈PNA陽性反應(yīng)，肌上皮細胞呈PNA陰性反應(yīng)。,刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA）主要分布于遠曲小管和集合小管上皮細胞，荊豆凝集素（UEA）主要分布在血管內(nèi)皮細胞，而麥芽素分布在腎小球。, 腫瘤中凝集素結(jié)合的改變 腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測出來。 凝集素可作為腫瘤特異性診斷的標記，腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。,第五節(jié) 鏈霉菌抗生物素蛋白檢測系統(tǒng),鏈霉菌抗生物素蛋白是從鏈霉菌中分離出來的不含糖基鏈的蛋白質(zhì)，分子量47kD，含4個亞基，每個亞基都能與一個生物素分子結(jié)合。,抗生物素蛋白等電點為10，而鏈霉菌抗生物素蛋白等電點為6.5，接近中性，幾乎不與組織中的內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合。因此，可產(chǎn)生低背景、高放大的效果。,一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ） 生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶結(jié)合。,操作步驟： 石蠟切片，脫蠟至水； 過氧化酶阻斷溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性； 第一抗體； 生物素標記的第二抗體； 鏈霉菌抗生物蛋白-過氧化物酶溶液； 顯色、復(fù)染、封片、觀察。,S-P試劑盒包括以下內(nèi)容： A. 內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑 B. 正常動物非免疫血清 C. 生物素標記的第二抗體 D. 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶,二、SABC法 鏈霉菌抗生物蛋白與一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈霉菌抗生物素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)。,SABC試劑盒包括以下內(nèi)容： 正常動物血清 生物素化二抗 SABC復(fù)合物,SABC具有以下特點： 高敏感性 低背景 簡便快速 結(jié)果穩(wěn)定,第六節(jié) 免疫金技術(shù)（膠體金）,1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原。 膠體金技術(shù)逐漸得到完善和成熟，應(yīng)用膠體金為標記物的免疫金染色（IGS）與免疫金銀染色（IGSS）方法在光鏡和電鏡下可以單標記和雙標記或多種標記同時觀察細胞和組織結(jié)構(gòu)，可以定性、定位、定量研究。,一、基本原理 膠體金即金的水溶液 分散體系：分散相 + 分散介質(zhì) 離子分散體系：以小分子或離子狀態(tài)分散 膠體分散體系：分散相顆粒1100nm 粗分散體系：,二、膠體金的一般性狀 1. 膠體金的顏色 膠體金顆粒在520nm之間，吸收波長520nm，呈葡萄酒紅色 2040nm之間，吸收波長530nm，呈深紅色 60nm，吸收波長600nm，呈蘭紫色,2. 膠體金的穩(wěn)定性 溶液的穩(wěn)定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的膠顆粒作布朗運動，不易受重力影響而下沉。然而溶膠又是不穩(wěn)定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積表大，當(dāng)膠粒相互碰撞時，有自動合并為較大、較重的顆粒的傾向。,三、在免疫細胞化學(xué)中的應(yīng)用 （一）免疫金染色 1. 免疫金法 1978年，Geoghegan等首次應(yīng)用免疫金探針檢測B淋巴細胞表面抗原，建立了光鏡水平的免疫金法（immunogold staining, IGS）,間接法：（以人肝組織HBsAg的定位為例） 石蠟切片脫蠟至水； 鼠抗HBsAg單克隆抗體（一抗），4過夜 金標兔抗鼠抗體（二抗） ， 37，45min ( 可以金標SPA代替) 復(fù)染（蘇木素）、封片、觀察、記錄,2. 蛋白A-膠體金（ PAG）放大法（以5-HT定位為例） 石蠟切片脫蠟至水； 兔抗5-HT抗體，4過夜，或 37 1 h PAG 37 1 h 抗A蛋白抗體， 45min，37 PAG， 37， 45min 復(fù)染、封片、觀察、記錄,PAG放大法的優(yōu)點： 使用試劑單一； 可大大提高IGS的敏感性，從而使應(yīng)用IGS方法定位抗原時使用高稀釋度的抗體成為可能； 背景干凈。,（二）免疫金銀法 將IGS與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀法（ immunogold-silver staining, IGSS）,基本原理： 膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子（Ag+）還原成銀原子(Ago)，被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大，最終抗原位置得到清楚放大。,以人肝細胞內(nèi)HBsAg定位為例 石蠟切片脫蠟至水； 馬抗HBsAg抗體，4過夜或37，12h PAG，37，45min 銀顯影 復(fù)染（蘇木素）、封片、觀察、記錄,四、優(yōu)點 1. 制備簡單； 2. 標記簡單：抗體、SPA、酶可通過物理吸附作用與膠體金顆粒形成穩(wěn)定的金標復(fù)合物； 3. 適用范圍廣：光鏡、透射電鏡、掃描電鏡、X線能譜分析等。 4. 特異性強：免疫金探針的非特異性吸附作用小，特異性高。,5. 敏感性高：用于電鏡，其檢測抗原或抗體的效率遠遠超過酶反應(yīng)物，大大改進了免疫組化在電鏡水平上的分辯率。光鏡金顆粒經(jīng)過銀顯影后得到放大，敏感性比PAP法高200倍，比ABC法高6倍，是迄今為止最為敏感的免疫細胞化學(xué)方法，特別適用于檢測微量抗原及石蠟切片標本中的微弱抗原。,雙標記及多重標記：膠體金制備成不同大小的顆粒，分別標記不同的抗原或抗體。,第七節(jié) 半抗原交聯(lián)抗體法,近年來，為提高敏感性和減低非特異性染色，在常規(guī)免疫組化技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了半抗原交聯(lián)抗體法（hapten-coupled technique），可作免疫酶或免疫熒光染色。,基本原理：半抗原標記第一抗體 半抗原：阿散酸（對氨基苯砷酸）、對氨基苯酰甘氨酸、亞對氨苯酰甘氨酸、二硝基苯氨基丙睛亞胺酸脂（DNP），通過酰胺化反應(yīng)把半抗原結(jié)合到抗體分子上。,操作程序： 間接法（二步法）： 石蠟切片脫蠟至水； 半抗原標記的特異性抗體（一抗）； 熒光素或酶標記的抗半抗原抗體 ； 熒光顯微鏡觀察，或加底物顯色。,優(yōu)點： 1. 敏感性高：由于本法是通過酰胺化反應(yīng)標記半抗原，對抗體活性損失極小，抗體保留較高的活性，能結(jié)合大量半抗原，平均每個球蛋白分子可同時結(jié)合20個半抗原分子，每個半抗原又可與抗半抗原抗體相結(jié)合，特異性免疫反應(yīng)明顯放大，其敏感性明顯高于常規(guī)的免疫酶和免疫熒光染色技術(shù)，特別有助于發(fā)現(xiàn)滴度低的同種抗血清和含抗原量較少的組織。,2. 可用于雙重免疫染色：利用兩種無交叉反應(yīng)的半抗原（如阿散酸、對氨基苯酰甘氨酸）分別標記來自同一種動物的兩種特異性第一抗體，即可在同一張切片內(nèi)同時顯示兩種不同的抗原。 3. 特異性強，敏感性高，背景染色低。,第八節(jié) 多聚螯合物酶法,多聚螯合物酶二步法，也稱非生物素檢測系統(tǒng)，與簡單的二步法相比，具有敏感性和特異性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。,一、EnVision System ( DAKO ) EnVision System是將二抗和酶通過一個多聚化合物（葡聚糖）骨架聯(lián)接成一個多聚體（即 EnVision ），每一個分子的復(fù)合物中約含70個分子的POD和10個分子的第二抗體，復(fù)合物中的POD的絕對數(shù)量遠高于其他復(fù)合物，直接放大信號 4050倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。同時，人體內(nèi)不存在該多聚化合物，無特異性干擾，故背景染色淺。,EnVision System工作程序： 1. 脫蠟、水化組織切片； 2. 一抗孵育 1030min; 3. PBS漂洗; 4. EnVision TM孵育1030min; 5. PBS漂洗 6. 顯色、復(fù)染、封片。,特點： 敏感 省時 方便 背景低 （避免了內(nèi)源性生物素干擾）,二. PowerVisionTM二步法: 是美國PowerVision公司推出的產(chǎn)品，其檢測效率高于En Vision法。,三. EPOS法 EPOS法（enhanced ploymer one-stop staining）是DAKO公司近年來推出的一步染色法。原理是采用一種惰性的多聚化合物（葡聚糖）為骨架，將特異性抗體（一抗）和POD結(jié)合在一起，形成POD-多聚化合物-特異性抗體巨大復(fù)合物。復(fù)合物內(nèi)不含第二抗體及親和素。,EPOS法操作程序： 1. 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水; 2. Dako EPOS/POD試劑，孵育3060min; 3. PBS漂洗 3min 3次; 4. 顯色、復(fù)染、封片。,四. UIP法 UIP（universal immuno-enzyme polymer）法，其原理是以氨基酸類為骨架，形成POD-氨基酸-二抗復(fù)合物（N-Histofine復(fù)合物）。由于多聚物中有N末端暴露，形成的電荷能與組織發(fā)生靜電吸附，可造成非特異性染色，染色時需平衡靜電荷。,第九節(jié) 組織芯片技術(shù),組織芯片又稱組織微陣列，是生物芯片的一種，將數(shù)十種、上百種甚至上千種的不同組織點在一張固體載體（通常是載玻片）?？梢园凑詹煌男枨笤O(shè)計組織排列，具有高通量、可比性強、節(jié)約大量成本的優(yōu)點，減少了實驗誤差，尤其適用于大樣本的研究。對研究疾病不同病理發(fā)展階段各基因表達的動態(tài)變化、相關(guān)基因驗證、治療靶點的定位、抗體和藥物的篩選等均有重大的使用價值。,組織芯片的制備： 1. 芯片的設(shè)計； 2. 根據(jù)設(shè)計將載體蠟塊打孔； 3. 觀察組織切片，在供體蠟塊上準確標記所需要的靶點； 4. 利用打孔儀鉆取靶點組織，并轉(zhuǎn)移至載體蠟塊相應(yīng)的孔位上，制成所需要的陣列蠟塊； 5. 常規(guī)切片。,第十節(jié) 原位雜交免疫組織化學(xué) （in situ hybridization histochemistry, ISHH）,分子雜交： 液相核酸分子雜交：在溶液中進行，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。 固相核酸分子雜交：斑點雜交 Southern 印跡雜交 Northern印跡雜交 原位分子雜交,一、原位雜交技術(shù)的發(fā)展 1970年，國外有學(xué)者利用同位素標記核酸探針進行細胞或組織的基因定位，從而開創(chuàng)了原位雜交技術(shù)。 熒光素標記探針進行原位雜交 熒光顯微鏡觀察 2,4二硝基苯甲酸（DNP）標記DNA探針，再結(jié)合酶標記抗DNP抗體（分子雜交 + 免疫組化技術(shù)） 地高辛標記探針 生物素標記探針 + ABC法,核酸探針分類： 1. 放射性探針 非放射性探針 2. DNA探針、RNA探針 cDNA探針、cRNA探針 寡核苷酸探針,原位分子雜交在近20年的發(fā)展可以說是飛躍的，在生命科學(xué)的研究中可視為一項革命性的技術(shù)，它使我們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平，為各個學(xué)科的研究帶來突破性進展。,二、原位雜交技術(shù)的基本方法 雜交前準備：包括固定、取材、玻片和組織的處理（增強核酸探針的穿透性，減低背景染色等） 雜交 雜交后處理 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。,1. 固定 要兼顧到三個方面： 保持細胞結(jié)構(gòu)； 最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA水平； 使探針易于進入細胞或組織。,對于DNA來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低水平。所以，不僅固定劑的種類、濃度和時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快冷凍或固定。,固定劑： 4%多聚甲醛 10%中性緩沖福爾馬林,2. 玻片和組織切片的處理 玻片的處理： 蓋玻片、載玻片 清潔液中浸泡24h（硫酸 + 重鉻酸鉀） 清水沖洗 蒸餾水沖洗 95%酒精浸泡24h 烘干（150，以去除任何RNA酶）,由于原位雜交的實驗周期較長，實驗程序繁雜。因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂沫在玻片上，常用的粘附劑有3-amino propy eriethoxy silame(APES)和多聚賴氨酸。,增強組織的通透性和核酸探針的穿透性： 稀釋的酸洗滌，Triton X-100，酒精或某些消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶等）。常用蛋白酶K，1g/ml，37，孵育15-20 min，然后應(yīng)用0.1 mol/L 的甘氨酸溶液清洗以終止蛋白酶K的消化作用。 4%多聚甲醛后固定 20 min。, 減低背景染色： 預(yù)雜交：預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 42 30min, 防止RNA酶的污染： 戴消毒手套 高溫（240）烘烤 雜交前及雜交時所應(yīng)的溶液均需 經(jīng)高壓消毒處理,3. 雜交 核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)靶核苷酸結(jié)合，雜交是原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵的一步。 雜交是將雜交液滴于切片的組織上，加蓋硅化的蓋玻片，也可不加蓋玻片。, 探針的濃度：0.5-5.0g/ml，一般應(yīng)用1-2g/ml。雜交液的量要適當(dāng)，以10-20l/每張切片為宜。 探針的長度：50-100個堿基之間。探針短，易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。, 雜交的溫度和時間：解鏈溫度（融解溫度）Tm：DNA探針90，RNA探針95。加30-50%甲酰胺于雜交液中，降低Tm。1%甲酰胺，Tm可降低0.72。原位雜交的溫度在Tm-25左右，即比Tm降低25，大約在30-60之間。,DNA探針或細胞內(nèi)靶核苷酸為DNA，則必須在80-95加熱使其變性，時間5-15 min。然后在冰上擱置1 min ，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入濕盒內(nèi)，37-42孵育雜交16-20h。, 硫酸萄聚糖和甲酰胺 硫酸萄聚糖的主要作用是促進雜交率。 甲酰胺的主要作用是調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度。,4. 雜交后處理： 雜交后有非特異性探針片段粘附在組織切片上，從而增加了背景染色。應(yīng)用系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液漂洗。 2 SSC（Standard Saline Citrate） 0.1 SSC,5. 顯示（檢測系統(tǒng)） 同位素標記：放射自顯影 銀顆粒 酶標記：堿性磷酸酶（過氧化物酶） 底物：四氮唑藍（NBT） 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP） 30l/每張切片，置暗處顯色30 min 2 h， 產(chǎn)物紫藍色（棕紅色）,6. 對照實驗 以不加核酸探針雜交液進行雜交 將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進行預(yù)處理后雜交,ISHH是最大優(yōu)點是它的高度特異性，可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。,三、DNA探針在原位雜交中的應(yīng)用 Dig標記DNA探針在石蠟包埋切片檢測病毒DNA中的應(yīng)用。 1. 組織前處理 固定 脫蠟 蛋白酶K 甘氨酸液 4%多聚甲醛后固定,2. 預(yù)雜交 封閉非特異性雜交位點，20l/每張切片，42 30min 3. 雜交 10-20l/每張切片，將切片置于95 10 min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1 min，然后將切片置于盛有2SSC濕盒內(nèi)，42 16-18 h,4. 雜交后漂洗 酶標（AP）抗地高辛抗體 37 30 min 5. 顯色：NBT + BCIP,四、原位雜交與免疫組織化學(xué)結(jié)合法 可在同一張切片或兩個相鄰的切片進行染色，這樣就可在同一細胞中顯示某種mRNA和相應(yīng)的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白、多肽合成的動力學(xué)。,可在相鄰切片上分別進行原位雜交和免疫組化，也可先后在同一切片上進行原位雜交和免疫組化，往往首先進行原位雜交，然后進行免疫組化。,堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體是經(jīng)木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段，沒有Fc段。而免疫組化應(yīng)用的抗體即有Fab段，又有Fc段。由于抗體的這一特性，可在原位雜交和免疫組化孵育時將檢測核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片。 產(chǎn)物：藍色，棕色,第十一節(jié) 細胞凋亡檢測方法,一、細胞凋亡的研究方法 光鏡或電鏡形態(tài)學(xué)觀察 細胞DNA提取物的DNA Ladder電泳實驗 凋亡細胞DNA斷裂點的原位標記實驗（TUNEL） 流式細胞術(shù)檢測 有關(guān)凋亡相關(guān)基因表達測定（原位分子雜交、免疫組化）,TUNEL 末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labling，）是檢測細胞凋亡較常用的方法,其主要原理為： 細胞凋亡中DNA斷裂是內(nèi)切酶的作用，其斷端3-OH暴露，這是凋亡細胞DNA斷裂的特征，以此區(qū)別細胞壞死DNA斷裂。 TdT是一種DNA修飾酶，它可以催化DNA斷裂點的3-OH末端合成多核苷酸聚合物，即DNA片斷加尾。在此反應(yīng)中，帶有地高辛、生物素、熒光素等標記物的單核苷酸可以被摻入到加尾聚合物中，完成對斷裂點的標記。,TUNEL是一種將生化技術(shù)與免疫組化相結(jié)合，在組織切片或細胞涂片上顯示細胞凋亡的新技術(shù)。由于不需要模板，每一標記處平均摻入4個左右的標記dUTP，因此敏感性較高。,操作程序（以熒光素-dUTP為例 POD TdT 3-OH端標記） 1. 石蠟切片，二甲苯脫蠟至水 2. 0.3%甲醛配H2O2處理，消除內(nèi)源性過氧