KJ05微生物快速檢測技術.ppt

8、微生物的快速檢測,常見微生物檢測項目,常規(guī)微生物項目：細菌總數、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數、霉菌總數。 致病微生物項目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等。,國家標準GB/T 4789 1-40：食品衛(wèi)生微生物學檢驗：菌落總數測定、大腸菌群計數、沙門氏菌檢驗、志賀氏菌檢驗、致泄大腸埃希氏菌檢驗、副溶血性弧菌檢驗、小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗、空腸彎曲菌檢驗、金黃色葡萄球菌檢驗、溶血性鏈球菌檢驗、肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗、產氣莢膜梭菌檢驗、蠟樣芽孢桿菌檢驗、霉菌和酵母菌計數、常見產毒霉菌的鑒定、椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗、單核細胞增生李斯特氏菌檢驗、腸桿菌科噬菌體檢驗、大腸菌群快速測定、雙歧桿菌檢驗、乳酸菌檢驗、大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗、阪崎腸桿菌檢驗等。,政府檢測機構為什么需要微生物快速檢測？,提高檢測效率 節(jié)約人力資源成本 與國際接軌,國內外食品安全形勢嚴峻，惡性事件不斷發(fā)生。 歐洲“二噁英”、“瘋牛病”（20世紀90年代） 日本大腸桿菌O157:H7中毒（1996） 中國SARS（2003） 、東南亞國家禽流感（2004） 美國菠菜大腸桿菌O157:H7污染事件（2006）,日益嚴峻的食品安全局勢的需要,企業(yè)為什么需要微生物快速檢測？,市場銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質期較短的產品。 減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金周轉。 節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出） 對于運行HACCP質量保證體系的企業(yè)來說，快速檢測方法尤其重要。可以快速檢測原料及半成品的污染情況，以采取相應的措施控制最終產品的微生物超標情況。,快速檢測方法勢在必行！,國外許多政府檢測機構都在大量使用快速檢測方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國外應用相當成功。 國內的許多政府檢測機構也都已經在使用或正在考慮使用國外先進的快速檢測技術。 從長遠發(fā)展趨勢來說，快速方法是微生物檢測的一大方向。,一、常規(guī)微生物快速檢測技術現狀,傳統計數改良法： 1、螺旋平板計數法：螺旋接種儀菌落計數 2、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測。 3、紙片法：培養(yǎng)基固定在載體上。省去制做培養(yǎng)基的時間。主要用于細菌總數檢測。 4、其它：如Simplate即用膠,改良MPN產品。,螺旋平板法,DWS螺旋平板接種儀,aColyte自動菌落計數儀,螺旋平板原理,平皿旋轉,接種針往外移動 同時自動將樣品 稀釋1000倍,螺旋平板法的優(yōu)缺點,優(yōu)點： 與傳統方法相比，無需稀釋3個梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。 缺點： 檢測時間并沒有縮短，菌落總數仍需要培養(yǎng)48小時。 需要配合自動菌落計數儀，否則人工計數更麻煩。,濾 膜 法,濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。 優(yōu)點：靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數。 缺點：需要額外的支出購買真空泵，多聯支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數要求特別嚴格的產品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。,皿膜法以紙片法為代表,優(yōu)點：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計數較方便。 缺點：不能節(jié)省檢測時間。檢測成本相對偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無法對應的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細菌總數紙片有一些用戶。,紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標餐具大腸菌群采用的就是紙片法。,其它即用膠，MPN改良法,Simplate,colilert,主要用于水樣或澄清樣品的大腸菌群或大腸桿菌檢測,SimPlateTMTPC 法：基于食源性細菌的蛋白質有特異性酶類，TPC培養(yǎng)基內含有多種細菌酶類所對應的底物。檢樣被細菌污染時，只要具有一種酶的活性即能與底物作用生成4-甲基傘形酮，培養(yǎng)24h后，在紫外線照射下，發(fā)出藍色熒光。 食源性細菌懸浮于TPC培養(yǎng)基表面，在分隔的小池內能迅速進行生化反應，若有檢樣顆粒亦無干擾；它不是由48h形成的菌落來計數，而是24h后在紫外燈照射下記錄培養(yǎng)皿內能發(fā)出藍色熒光的陽性池數，進而由最大近似值(MPN) 表查出細菌的MPN。陽性池數與MPN 呈松泊分布。,固定底物技術酶底物法，需要coliert試劑 采用大腸菌群細菌能產生D-半乳糖苷酶分解ONPG（鄰硝基苯-D-半乳吡喃糖苷）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基傘形酮-D-葡萄糖醛酸苷 ）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產生熒光的原理，來判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。只需24小時即可同時定量出水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。,二、常規(guī)微生物快速檢測技術現狀,快速檢測微生物數量的新方法： 1、ATP法：目前產品較多，如CHARM，Biotrace, 等。 2、電化學法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo, 3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。 4、流式細胞技術及激光掃描技術 5、其它：熱量法，放射測量法,表面潔凈的檢測方法,微生物學法：紙片、瓊脂板、棉簽拭子、海綿拭子 非微生物學法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白質, 降解糖、NADP(輔酶II)，其它。,ATP-三磷酸腺苷,ATP來源于,細菌 酵母 霉菌 生物膜 組織殘留,廢棄物污染 人的污染,（一）ATP法,1. 人接觸設備或器具 2. 設備或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染,ATP 存在表明什么？,檢測原理,熒光素,熒光素酶,腺苷一磷酸,氧合熒光素,熒光,ATP法兩大用途,1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對生產線和管道進行快速清潔程度檢測。政府檢測機構用ATP方法缺乏法律依據。ATP法與微生物數量沒有必然的聯系。 2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測或終產品檢驗。,LUMT清潔程度快速檢測,1)將水樣在玻璃纖維過濾器上過濾以便富集微生物； 2)用適當的溶解劑溶解細胞； 3)用適當的萃取劑萃取ATP； 4)將ATP的萃取液加到盛有螢光素、螢光素酶的試管中，并用光度計記錄下所產生光的量，將此讀數和ATP濃度標準曲線相比較，就可得到待測樣品中ATP含量；用得到的ATP含量確定水樣中細菌數量。,LUM-T的獨特優(yōu)勢,CHEF 熟肉制品成熟度檢驗 MicroQ 水中微生物污染程度檢測 Cidelite 殺蟲劑殘留初篩 Paslite 牛奶巴氏消毒效果 Somalite 體細胞計數 SL/MRL test 抗生素殘留檢測（連接ROSA imager),Charm ATP 檢測,基于ATP原理的用于成品檢測的 微生物檢測系統,Charm LUM-96 （用于UHT產品-高溫瞬間滅菌） Biotrace Celsis（主要用于化妝品） Millipore公司的MicroScan,Celsis和LUM-96,保溫2天，檢測30分鐘（96個樣）,ATP法檢測成品的優(yōu)缺點,優(yōu)點：LUM-96通常用于進行商業(yè)無菌檢測?？纱蟠罂s短庫存時間，減少物流壓力和成本。 缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個檢測代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測，其風險是一定存在的。(如保溫增菌時間不夠，菌數未達到一定數量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標致病菌未大量增菌等原因),Millipore公司最新推出的MicroStar,MicroStar的原理及局限性,MicroStar快速微生物檢測系統是結合了生物熒光、膜過濾及CCD熒光照相檢測等技術的新型檢測系統. 可過濾樣品經膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素和熒光素酶，顯示的熒光信號在熒光顯微鏡或熒光檢測器下觀察并計數。,MicroStar的優(yōu)缺點,優(yōu)點：縮短培養(yǎng)時間，提高靈敏度。適合于菌數較低的可過濾產品使用。 缺點：儀器較昂貴，運行成本也非常貴。不能用于檢測未知的可能菌數較高的樣品(不知稀釋多少倍，因菌數必須稀釋至80個左右)。整個檢測時間還不夠快，通常需16小時以上。,（二）電化學方法(電導率法或電阻抗法),奧地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200 梅里埃公司的Bactometer和Tempo 英國Multhus公司(已倒閉) 英國DWS公司的Rabit ,外觀比較,Bactrac4300,梅里埃的BactoMeter,DWS公司的Rabit,馬色斯120,世界上最好的電化學微生物快速檢測產品 Bactrac 4300系統,Sy-lab Bactrac4300常規(guī)微生物項目快速檢測技術,MicroFoss(Biosys) 微生物自動監(jiān)測儀,微生物生長導致培養(yǎng)基 pH值發(fā)生變化，由光學 檢測器檢測底部瓊脂層 的顏色變化，記錄達到 突變點的時間。,Microfoss的特點,與阻抗法類似，可以實現快速檢測。 缺點：需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基，應用范圍受限制，成本高昂。因此在我國目前還沒有用戶。,梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀,基于微生物生成產生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數量有一定關系。,方法較新，用戶還需要一個過程了解。,流式細胞計數技術,用于非過濾產品,流式細胞 : 線性流體 單細胞分析 靈敏的檢測頭,流式細胞術（FCM）是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數的、快速的定量分析和分選的技術,（三）流式細胞技術及激光掃描技術,FOSS公司 BactoScan FC牛奶中總菌數快速檢測儀,采用流式細胞原理。對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術進行計數,BactoScan FC的優(yōu)缺點,優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時) 缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。 適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數。,美國Chemunex公司 微生物快速檢測系統,美國Chemunex公司將流式細胞技術與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術相結合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。 其最大的特點是只檢測活細胞數，速度極快，處理量大。與FOSS的BactoScan FC檢測死活細胞都檢測不同。 是目前國際上正在認可的生物熒光定量檢測微生物數量的兩種方法之一。另一種是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP檢測的產品。,熒光酶標記原理,直接單細胞標記 (包括孢子) 細胞無增菌要求 標記在90分鐘內完成 直接對活細胞和酵母進行標記,標記的細菌,標記后的酵母,標記后的霉菌,ChemScan RDI,三個簡單的步驟,2. 標記,3. 激光掃描,1. 過濾,檢測步驟 - TVC,1. 過濾,2. 標記,3. 激光掃描,樣品過濾,預標記 60 min,濾膜轉移,ChemScanRDI 儀器分析,標記 30 min,ChemScan RDI 主機,激光掃描分析儀 3 分鐘分析時間 結果直接顯示細胞個數,Laser scanning,Microscope Confirmation,Bactiflow,適合實驗室或研究用 日處理量不大于40個樣品,DCount,適合實驗室或生產現場使用 日處理量大于40個樣品的場合,標記和檢測原理,Enzyme,Viability substrate,Free fluorochrome,Micro-organism,Detector,Detector,Laser,Flow Cell,細胞標記 12 minutes,細胞計數 1 minute,自動吸樣 無需預處理 每批可做64 個樣，含陰性和陽性質控,最小的人力要求,全自動標記和過濾 加所有要求的標記試劑 控制溫育時間和溫度 去除大的顆粒 (25 m尼龍網過濾),快速敏感的分析 每小時50個樣品 直接按 個/mL顯示結果,數據處理,區(qū)分微生物和顆粒的功能強大 產品應用范圍廣 增強靈敏度 直接顯示細胞數 無需數據解釋 直觀易讀 完整的數據追溯性 易于確證,三種型號的差異,哪些類型客戶可以使用？,大型食品、化妝品、藥品企業(yè)，對快速檢測速度及樣品處理量要求高。 目前儀器非常貴，運作成本與免疫法相似。,三、致病菌快速檢測方法,顯色培養(yǎng)基法：技術成熟，產品很多。 免疫學方法：產品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結果需要確認。通常的原理有EIA（酶聯免疫），ELISA（酶聯免疫吸附試驗），GLISA（夾心酶聯免疫吸附法 ），熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場上的產品多，如BioMeriux,Tecra, Neogen,Biocontrol, Matrix等。 分子生物學方法：以基因探針檢測法和PCR法為主。 基因芯片：研究熱點。,致病微生物快速檢測產品,免疫磁分離法 Matrix公司的Pathatrix致病菌快速檢測系統,ELISA方法澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測,分子生物學方法(基因探針及PCR方法),GLISA-膠體金免疫層析致病菌快速檢測條,熒光酶免Vidas系列產品(略),顯色培養(yǎng)基 法國AES公司,GLISA膠體金免疫層析檢測條,氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。 膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡便。 關鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯，在親水紙層析條上固定。 膠體金微生物檢測條在國內已經有不少產品，但用戶并不多，主要是質量不穩(wěn)定。 外來的膠體金微生物檢測產品比較多。,（一）免疫學方法,常見的膠體金檢測條舉例,大腸桿菌O157,李斯特氏菌,沙門氏菌,膠體金檢測條的優(yōu)缺點,膠體金檢測方法屬于免疫檢測法，檢測的是死菌和活菌。 一般需要增菌過夜。 增菌后的檢測非常簡單，約10分鐘一般能完成。 無需專門的檢測儀器。 進口的檢測條的價格比較高，通常要3090元。,（二）分子生物學方法,基因探針法及PCR方法在國外已經有相當成熟的表現。 有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法。 基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結果。 PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術判斷結果。,分子生物學方法應用前景,試劑盒開發(fā)相對比較容易。只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。 目前客戶比較關注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應。,常見的基因探針方法或儀器,BAX Gene-trak Gen-probe Vermicon ,分子生物學方法病原菌檢測系統的優(yōu)缺點,分子生物學方法檢測致病菌，特異性較強，技術較為前沿，特別是相對國標方面來說。 但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。 速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢 目前不少產品已經通過AOAC的認證。,（三）顯色培養(yǎng)基技術,用顯色培養(yǎng)基鑒定微生物是一種新的微生物快速檢測技術。該技術以生化反應為基礎, 通過在培養(yǎng)基中加入細菌特異性酶的顯色底物直接根據菌落顏色對菌種作出鑒定。常見食源性致病菌檢測中, 李斯特菌顯色培養(yǎng)基(BCMTM L isteria m onocy togenes, Rap idLMONO agar, CHROMagarTM L isteria) 、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarTM Ecoli) 、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(Rambach agar) 、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar S taphy lococcusaureus) 等已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境監(jiān)測等領域, 極大提高了微生物檢測的效率。但是, 顯色培養(yǎng)基也存在一些假陽(陰) 性等問題, 其設計尚待優(yōu)化。,大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,利用大腸桿菌( Escherichia coli)特異性酶檢測鑒定大腸桿菌已十分普遍, 大約96%98%的大腸桿菌產生2D2葡萄糖苷酸酶(2D2Gud) , 絕大部分沙門氏菌、志賀氏菌和耶爾森氏菌不能產生Gud, 因此利用Gud酶底物可以有效的檢測大腸桿菌。 目前開發(fā)的顯色培養(yǎng)基常用酶底物有: 52溴242氯232吲哚22D2葡萄糖苷酸(X2Gluc) 、鄰硝基酚2D葡萄糖苷酸(PNPG) , 底物被Gud水解后產生顯色物質使菌落呈現特殊的藍色或黃色。法國科瑪嘉CHROMagar Ecoli是目前應用較廣泛的大腸桿菌顯色培養(yǎng)基, 在這種培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后, 大腸桿菌呈現藍色菌落。,沙門氏菌顯色培養(yǎng)基,沙門氏菌( Salmonella spp.)也是一類重要的食源性致病菌, 常規(guī)分離鑒定需要非選擇性預增菌、選擇增菌、選擇分離平板鑒定等步驟, 操作十分繁瑣。 德國Merck公司生產的顯色培養(yǎng)基Rambach agar以丙烯乙二醇和52溴242氯232吲哚22D半乳糖吡喃糖苷酸(X2GAL) 為底物檢測沙門氏菌, 沙門氏