高通量篩選技術(shù)應(yīng)用

高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用,高通量篩選（ HTS）又稱大規(guī)模集群式篩選，是由高容量 化合物庫、自動化操作、高靈敏度檢測、高特異篩選模型、 高效率數(shù)據(jù)處理 5 個子系統(tǒng)有機(jī)組合而成，是一種新型、 高自動化、高靈敏度、高通量的篩選技術(shù)。,其理論基礎(chǔ)是反向藥理學(xué)（ reversepharmacology），即基 于受體、酶及離子通道等分子、細(xì)胞水平藥物作用靶點， 從 現(xiàn)有化合物庫中篩選出具有生物活性的先導(dǎo)化合物，在此基 礎(chǔ)上再進(jìn)行組織、器官及疾病相關(guān)動物模型研究,TEXT,高通量篩選技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,TEXT,高通量篩選技術(shù)在酶工程領(lǐng)域的應(yīng)用,TEXT,高通量篩選技術(shù)在基因領(lǐng)域的應(yīng)用,高通量篩選( high-throughout screening)是近年來迅速發(fā)展起來的藥物篩選技術(shù) ,它通過運(yùn)用基 因科學(xué) 、蛋白質(zhì)科學(xué) 、分子藥理學(xué) 、細(xì)胞藥理學(xué) 、微電子技術(shù)等多學(xué)科理論和技術(shù) , 以及與疾病相關(guān)的酶和受體為作用靶點 ,對天然或合成化合物進(jìn)行活性測試 , 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選 。 高通量篩選具有快速 、高效 、經(jīng)濟(jì) 、高特異性等優(yōu)點 ,其中所用的樣品量甚少的特點 尤其適用于天然化合物的活性篩選,藥物高通量篩選技術(shù)分類（篩選平臺）：分子平臺、細(xì)胞平臺、酵母平臺、動物平臺,動物平臺。前兩種平臺都是體外模型，有些藥物在 體外模型中雖然能夠顯示良好活性，但是進(jìn)入動物 體內(nèi)檢測的時候活性卻大大降低，甚至沒有活性。 主要原因是由于在動物體或人體中， 藥物作用的發(fā) 揮不僅需要藥理活性，還與它的分布、吸收、代謝、 排泄有關(guān)。有些體外活性良好的藥物，由于脂水分 配系數(shù)問題， 導(dǎo)致機(jī)體不能吸收，或是不能正確分 布到作用靶位點，所以體內(nèi)活性大幅度降低。動物 平臺是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù)，在一些疾病的研 究上已經(jīng)顯現(xiàn)了重要作用，但仍舊需要不斷完善。,由于天然藥物中成分復(fù)雜性及多種成分間可能存在的協(xié)同作用 , 因此有效成分的分析 、鑒定和篩選是天然藥物開發(fā)中的一個難題。同時,許多天然藥物臨床資料相對不足, 仍需要進(jìn)行必要的再認(rèn)識和驗證 。面對海量的天然藥物 , 高通量篩選技術(shù)特有微量 、快速 、靈敏和準(zhǔn)確等特點。,特點：理性設(shè)計和定向進(jìn)化,現(xiàn)階段人們還沒有完全掌握對酶的空間構(gòu)象預(yù)測 、結(jié)構(gòu)分析 等技術(shù) , 所以試圖通過理性設(shè)計達(dá)到改善酶特性的目的仍然很 難實現(xiàn) , 因此 , 通過非理性設(shè)計特別是定向進(jìn)化技術(shù)來改造酶 特性的策略依然是人們關(guān)注的焦點。 酶的定向進(jìn)化包括兩個重要的步驟 , 首先是變異體庫的建立 , 其次是對最適突變體的篩選與鑒定,篩選方法分類：,分光光度測量法和熒光檢測法：,Rey mo nd 與其同事利用 傘形酮建立了一種巧妙的 高通量篩選方法優(yōu)點在于 底物能在比較高的溫度或 者比較寬的 pH 范圍內(nèi)保 持穩(wěn)定 , 并且可以通過構(gòu) 建不同的底物來檢測不同 的酶 。,酸檢測法：是一種經(jīng)常應(yīng)用于脂肪酶或者酯酶的高通量篩選方法 , 主要包括 pH 指示劑法 、乙酸法以及最近出現(xiàn)的熒光鈉鹽法 。,熒光鈉鹽( uoresceinsodium salt ) 是一種具有綠色熒光的有機(jī)鹽 , 當(dāng)用該鹽作為酶促反應(yīng)的指示劑時 , 隨著反應(yīng)體系中酸的增加 , 該鹽的熒光會逐漸被 H +離子所淬滅 , 因此 , 通過檢測其在 495 nm 處吸光值的變化我們便可以檢測出酶促反應(yīng)的速率,酵母表面展示技術(shù) ( Surface Display)是一類篩選蛋白質(zhì)突 變體庫的高通量篩選方法, 在抗體蛋白的研究中應(yīng)用尤其廣 泛, 具有高效、靈敏等特點。,基本原理：將外源目的蛋白基因整合到特定的載體后, 通過 電轉(zhuǎn)或其他的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入酵母細(xì)胞, 用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋 白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將目的蛋白移至細(xì)胞表面并且固定在細(xì)胞膜上。,酵母表面展示技術(shù)：作為真核表達(dá)系統(tǒng), 它具有的翻譯后加工 機(jī)制對真核蛋白來的表達(dá)來說其優(yōu)越性是顯而易見的 ; 其次, 該方法將酶固定在細(xì)胞的表面, 從某種意義上來說它起到了固 定化的效果, 而這種效果有可能顯著的提高酶的活力或者對映 選擇性; 最后, 它是一種真正意義上的高通量篩選方法, 通過熒 光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)，每次可以對106 1010個突變體進(jìn)行篩選,RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強(qiáng)大的實驗工具， 利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的 目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉 寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進(jìn) 行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物， 是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。,因此， 高通量 siRNA 篩選技術(shù)也成為生物學(xué)最強(qiáng)有 力的研究工具之一,高通量篩選技術(shù)在基因領(lǐng)域的應(yīng)用：,將文庫siRNA逐一轉(zhuǎn)染到孔板的每個孔， 72 h后， 基因被沉默降低到一定程度。加入包被I-SceI的腺病毒， 侵染細(xì)胞過表達(dá)I-SceI。 48 h后， 細(xì)胞內(nèi)sensor上靶點序列被I-SceI切割， 誘導(dǎo)同源重組。 將細(xì)胞固定染色， 通過高通量篩選儀器獲取信號， 進(jìn)行分析統(tǒng)計。,逐一篩選法：,包括4個步驟: 針對基因編碼區(qū)靶點的DNA序列在芯片上合 成后，通過公用的接頭， PCR克隆進(jìn)入慢病毒載體，并包 裹病毒；將慢病毒文庫侵染細(xì)胞，啟動shRNA序列表達(dá)的 序列被整合到細(xì)胞基因組上，而沉默細(xì)胞內(nèi)該基因的表達(dá)； 在特定時間、藥物誘導(dǎo)下，存活下來的細(xì)胞得以擴(kuò)增；提 取細(xì)胞的基因組，深度測序，找到相應(yīng)shRNA拷貝數(shù)。,文庫篩選法：,高通量siRNA篩選的新發(fā)展方向：,基于自組裝細(xì)胞芯片的細(xì)胞遷移篩選流程圖,自組裝細(xì)胞芯片是在一張玻璃片上覆蓋 PNI膜，通過 刻蝕產(chǎn)生規(guī)則的小孔矩陣。PNI 膜具有溫度敏感性， 低溫下遇水快速溶解， 細(xì)胞無法在其上生長。 每個 小孔的孔徑可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)， 保證其中 容納的細(xì)胞數(shù)在 1 000 個左右，具有統(tǒng)計意義。通過 反向轉(zhuǎn)染，可以在刻蝕產(chǎn)生的小孔內(nèi)點上 RNAi 文庫； 在整個芯片上鋪細(xì)胞，形成細(xì)胞島，每個小島就是一 個獨立的樣本。一張 4 cm2 的芯片上，可以容納 1212 個點，篩選容量超過一個 96 孔板。自組裝芯 片具有良好的平行性，孔與孔之間交叉污染極少，可 以有效地保證實驗準(zhǔn),高通量篩選技術(shù)具有以下幾方面的發(fā)展趨勢： 采用基于細(xì)胞的分析篩選方法，可直接在活細(xì)胞內(nèi)檢測化合物，提高篩選的準(zhǔn)確性； 采用精確的檢測