生物化學酶的催化機制PPT課件.ppt

酶的催化機制,酶催化機理研究的主要方法,（1）找出保守性的氨基酸殘基 得到不同生物來源的同一種酶的一級結構以后，將 它們進行對比，找出高度保守的氨基酸，可以獲得一 些可能與催化有關的氨基酸殘基的信息。在酶的進化 中，保守性越高的氨基酸殘基對酶的三維結構和功能 貢獻越大，這些氨基酸殘基很可能直接與酶的催化機 制有關。例各種絲氨酸蛋白酶的一級結構對比，His （組氨酸）57、Asp（天冬氨酸）102、Ser195不變， 事實證明，這三種氨基酸殘基直接參與肽鍵的水解。,（2）三維結構的研究 酶的三維結構決定了酶的功能，如果得到酶的三維 結構信息，對酶的催化機制的研究提供最直接的線索 。獲得酶三維結構的方法有X射線衍射和NMR。 （3）定點突變 分子生物學技術的發(fā)展使對蛋白質定點突變變的很 容易，所以只要得到一個酶的基因，就可以對其氨基 酸序列進行任意的突變。如果對一個酶氨基酸殘基進 行有的放矢的突變，會對酶的作用機制研究提供有價 值的信息。把胰蛋白酶活性中心裂縫底部的Asp189突 變成不帶電荷或帶正電荷的氨基酸殘基，胰蛋白酶活 性完全喪失。胰蛋白酶只水解堿性氨基酸殘基與其他 氨基酸氨基形成肽鍵，所以Asp189通過側鏈的負電荷 與底物上的堿性氨基酸殘基帶正電荷的側鏈結合。,（4）動力學分析 動力學分析可以為研究酶的作用機制提供有用的數(shù) 據。 （5）化學修飾 用雙功能試劑對酶的修飾有助于確定在三維結構上 相鄰的基團。借助底物或競爭性抑制劑的保護，可以 通過化學修飾確定活性中心的氨基酸殘基的性質。 例：假定一個酶分子上有6個Csy殘基，但又無法確 定它的活性中心是否有或者有幾個Csy殘基，可以分 別在有或無過量底物存在下，用碘代乙酸修飾酶，然 后進行對比，在底物保護的情況下，不能被修飾的 Csy殘基就在活性中心。,過渡態(tài)穩(wěn)定學說,根據過渡態(tài)理論，在任何一個化學反應體系中，反應物需要到達一個特定的高能狀態(tài)以后才能發(fā)生反應。這種不穩(wěn)定的高能狀態(tài)被稱為過渡態(tài)。達到過渡態(tài)要求反應物必須含有足夠的能量以克服活化能，然而，一個反應系統(tǒng)中各反應物分子具有不同的能量，只有某些反應物才含有足夠的能量去進行反應。 一個雙分子HA-HB和單原子HC之間形成一個新的HB-HC和HA ，反應發(fā)生需要形成不穩(wěn)定的過渡態(tài)HA-HB-HC,HA-HB + HCHA-HB-HC（過渡態(tài)）HB-HC + HA,G活為反應活化能HA-HB-HC為過渡態(tài)中間物。過渡態(tài)中間物既不是產物，也不是底物，而是介于舊化學鍵減弱，新化學鍵開始形成的一種不穩(wěn)定的結構狀態(tài)?；罨芤膊皇欠磻目傋杂赡茏?，自由能變與反應平衡時底物濃度和產物濃度有關，而活化能與反應速度有關?；罨茉降秃凶銐蚰芰康姆磻锓肿釉蕉?，反應發(fā)生的越快。提高溫度或其他因素的作用可以促進更多的反應物達到過渡態(tài)，提高反應速度。所有的催化劑都是通過降低活化能加快反應速率。,過渡態(tài)中間物,化學反應的過渡態(tài)及其前后的自由能變化,酶與過渡態(tài)的親和力要比對基態(tài)（底物）的親和力高得多，酶的催化源于其對過渡態(tài)的穩(wěn)定作用。 酶把反應分成幾步，因為酶與過渡態(tài)的中間物結合比和基態(tài)（底物）的結合更牢、更好而穩(wěn)定反應的過渡態(tài)，從而降低活化能，加快反應速度。 單底物反應SP：如果沒有酶，S要克服能障變?yōu)檫^渡態(tài)后再反應生成P。如果有酶催化，通過分子碰撞，酶與底物先形成可逆復合物ES。ES形成的結合能一部分用來驅動過渡態(tài)復合物形成。經過EP復合物，最終釋放出產物P和自由酶E。形成過渡態(tài)復合物需要的活化能比單獨形成過渡態(tài)底物所需的活化能低，導致總反應活化能顯著下降，所以酶促反應速率大大增加。但是，酶不能改變反應的總自由能變，也就是它不影響反應的平衡方向。,酶促反應和非酶促反應過程的自由能變化,過渡態(tài)穩(wěn)定的化學機制,與酶催化相關聯(lián)的過渡態(tài)穩(wěn)定是酶活性中心結構和反應性以及活性中心與結合底物之間的相互作用的必然結果。酶充分使用一系列的化學機制來實現(xiàn)過渡態(tài)的穩(wěn)定并由此加速反應。這些機制歸納起來主要有六種機制： （1）鄰近定向效應； （2）廣義的酸堿催化； （3）靜電催化； （4）金屬催化； （5）共價催化； （6）底物形變。,鄰近定向效應,鄰近定向效應是指兩種或兩種以上的底物（特別是雙底物）同時結合在酶活性中心上，相互靠近（鄰近），并采取正確的空間取向（定向），這樣大大提高了底物的有效濃度，使分子間反應近似分子內反應從而加快了反應速度。 底物與活性中心的結合不僅使底物與酶催化基團或其它底物接觸，而且強行“凍結”了底物的某些化學建的平動和轉動，促使它們采取正確的方向，有利于鍵的形成。,廣義的酸堿催化,廣義的酸堿催化是指水分子以外的分子作為質子供體或受體參與催化，這種機制參與絕大多數(shù)酶的催化。蛋白質分子上的某些側鏈基團（如Asp、Glu和His）可以提供質子并將質子轉移到反應的過渡態(tài)中間物而達到穩(wěn)定過渡態(tài)的效果。如果一個側鏈基團的pKa值接近7，那么該側鏈基團就可能是最有效的廣義的酸堿催化劑。蛋白質分子上的His組氨酸殘基的咪唑基就是這樣的基團，因此它作為很多酶的催化殘基。,廣義的酸堿催化和特定的酸堿催化的差別： （1）特定酸堿催化是H+或OH-加速反應，廣 義的酸堿催化是酶分子上的酸性和堿性基團催 化反應。 （2）緩沖溶液對他們的影響不同。特定酸堿 催化反應速率只取決于pH，與緩沖溶液濃度無 關，廣義的酸堿催化，緩沖溶液有助于通過提 供或奪取質子來穩(wěn)定過渡態(tài)，反應速度取決于 底物和酶的質子化狀態(tài)，還取決于緩沖溶液的 濃度。緩沖溶液濃度的升高提高了廣義酸堿催 化的效率。,靜電催化,活性中心電荷的分布可用來穩(wěn)定酶促反應的過渡態(tài)，酶使用自身帶電基團去中和一個反應過渡態(tài)形成時產生的相反電荷而進行的催化稱為靜電催化。 有時，酶通過與底物的靜電作用將底物引入到活性中心。,溶菌酶Glu35將質子交給糖苷鍵上的O原子以后，O因此帶上正電荷，隨后糖苷鍵斷裂，左邊的糖基1號位的C原子帶上正電荷，鄰近的Asp52的羧基本來于解離狀態(tài)，帶負電荷，起著中和正電荷穩(wěn)定過渡態(tài)的作用。,溶菌酶的最適pH與Glu35和Asp52的解離狀態(tài)有關,金屬催化,近三分之一已知酶的活性需要金屬離子的存在，這些酶分為兩類，一類為金屬酶，另一類為金屬激活酶。前者含有緊密結合的金屬離子，多數(shù)為過渡金屬，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者與溶液中的金屬離子松散地結合，通常是堿金屬或堿土金屬，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。 金屬離子參與的催化被稱為金屬催化。金屬離子以5種方式參與催化：（1）作為酸接受電子，使親核基團或親核分子親核性更強；（2）與底物結合，促進底物在反應中正確定向；（3）作為親電催化劑，穩(wěn)定過渡態(tài)中間物上的電荷；（4）通過價態(tài)的可逆變化，作為電子受體或電子供體參與氧化還原反應；（5）酶結構的一部分。,共價催化,共價催化是指酶在催化過程中必須與底物上的某些基團暫時形成不穩(wěn)定的共價中間物的一種催化方式。許多氨基酸殘基的側鏈可作為共價催化劑，例如Lys賴氨酸、His組氨酸、Cys半胱氨酸、Asp天冬氨酸、Glu谷氨酸、Ser絲氨酸或Thr蘇氨酸，此外，一些輔酶或輔基也可以作為共價催化劑，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸吡哆醛。,幾種酶的共價催化,Y比X更好的離開基團，X是比Z更好進攻的基團，共價中間物的反應性比底物強。,親核共價修飾反應,底物形變,底物形變是指當酶與底物相遇時，酶分子誘導底物分子內敏感鍵更加敏感，產生“電子張力”發(fā)生形變，比較接近它的過渡態(tài)。,底物形變,溶菌酶也利用這種方式進行催化：與溶菌酶活性中心結合的6碳糖在溶菌酶的誘導下，從椅式構象變成半椅式構象而發(fā)生形變，周圍的糖苷鍵更容易發(fā)生斷裂。,幾種常見酶的結構與功能,蛋白酶,蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶的總稱。盡管肽鍵的水解在能量學上是十分有利的，但如果沒有蛋白酶的催化，一個肽鍵在中性pH和25條件下大概需要300年600年的時間才能完成水解。 根據活性中心催化基團的性質，蛋白酶可以分為四類：（1）絲氨酸蛋白酶此類蛋白酶的催化基團包括1個不可缺少的Ser殘基，DIFP是它們的不可逆抑制劑；（2）金屬蛋白酶這類蛋白酶在活性中心結合金屬離子，其活性絕對需要金屬離子，因此金屬離子的螯合劑EDTA或鄰菲羅啉的存在可導致其活性的喪失；（3）天冬氨酸蛋白酶其催化基團包括兩個重要的Asp，在偏堿性的pH下無活性；（4）巰基蛋白酶其催化基團包括1個Cys的巰基，巰基試劑為它們的不可逆抑制劑。,所有蛋白酶在催化過程中都經歷四面體的過渡態(tài)，該過渡態(tài)形成的原因是反應涉及一個親核基團進攻肽鍵的羰基碳。如果是絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，進攻的親核基團分別是Ser殘基的羥基和Cys殘基的巰基，否則就是水分子。絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的催化機理中包括共價催化，脂?；甘敲概c底物的共價中間物，而金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反應更為直接，沒有共價催化。,絲氨酸蛋白酶,這一類蛋白酶以一個特定的Ser殘基作為必需的催化基團，屬于該家族成員的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、激肽釋放酶原、凝血酶、纖溶酶和組織型纖溶酶原激活劑。 絲氨酸蛋白酶的催化機制屬于共價催化和廣義酸堿催化的混合體，由三個不變的氨基酸殘基構成的催化三元體（Ser、His和Asp（天冬氨酸）起主導作用，這三個氨基酸殘基任何一種突變或修飾（例如，Ser被DIPF修飾）均可導致酶活性的喪失。,雖然各種絲氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但構成催化三元體的三個氨基酸殘基在肽鏈中的位置并不完全相同。然而，酶學家已達成共識，將這三個氨基酸殘基總是進行一樣的編號，即His57、Asp102和Ser195。它們在催化中的具體功能是：（1）Ser195充當進攻底物的親核基團；（2）His57作為廣義的酸堿催化劑；（3）Asp102 的功能僅僅是定向His57，影響His的 pKa，改變其酸堿性質。,胰蛋白酶具有很深的底物結合口袋，而口袋的底部又是Asp，特別適合長的堿性氨基酸側鏈（Lys賴和Arg精）的結合；胰凝乳蛋白酶的底物結合口袋沒有胰蛋白酶深，但比它寬，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特別適合芳香族氨基酸的結合；彈性蛋白酶的底物結合口袋非常淺，最適合結合側鏈較小的氨基酸殘基。,糜蛋白酶的催化經歷了酯?；腹矁r中間物，全部反應分五步：,1、底物和活性中心的Ser195和Gly（甘）193 殘基通過氫鍵形成ES復合物，疏水口袋正好能 容納芳香環(huán)。 2、親核的Ser195殘基進攻羰基碳，形成第一 個四面體的過渡態(tài)中間物。 活性中心的三個氨基酸殘基依次參與此階段 的反應,糜蛋白酶催化的四 面體中間物的形成,糜蛋白酶催化形成的 四面體中間物的穩(wěn)定,3、四面體中間物因肽氧負離子與Ser195以及Gly193之間形成氫鍵而穩(wěn)定。 4、肽鍵斷裂，離開基團從His57咪唑環(huán)上得到一個質子。原來肽鍵羧基一側通過氫鍵以及與Ser195形成共價鍵仍與酶結合。 5、水進入活性中心，質子化His57，使之成為酸。釋放出來的OH-親核進攻留下來的多肽羰基碳，第二個四面體形的過渡態(tài)中間物形成。最后Ser195從His57重新獲得質子，His仍然與它通過氫鍵相連，過渡態(tài)中間物瓦解，酯?；钢虚g物被水解。,天冬氨酸蛋白酶,活性中心涉及兩個重要的Asp殘基，他們交替充當廣義的酸堿催化劑。多數(shù)天冬氨酸蛋白酶都具有由兩葉（N端和C端各成一葉，每一葉相當一個結構域）組成的三級結構，兩葉呈兩重對稱。屬于這一蛋白酶家族的有胃蛋白酶，腎素、組織蛋白酶等。在中性或偏酸條件下活性最高，與絲氨酸蛋白酶一樣，在功能上要么是消化酶，要么是調節(jié)酶。其催化機制為：,1、水和多肽底物進入兩重對稱的活性中心。 2、兩個Asp殘基的羧基具有不同的pKa。pKa高的Asp殘基上羧基作為廣義堿從水分子中抽取一個質子，產生的OH-親核肽鍵上的羰基碳，形成氧負離子。后者親核進攻活性中心pKa低的Asp215殘基上的羧基，奪取質子。第二個Asp殘基充當廣義酸，為氧負離子提供質子，形成四面體狀中間物。 3、Asp32和Asp215相互之間酸堿反應，質子從Asp32傳到Asp215。 4、 Asp32和Asp215的酸堿催化導致四面體中間物拆分，產物釋放，最后Asp32和Asp215再次進行質子交換，各自回到催化前狀態(tài)。,酶活性的調節(jié)機制,酶需要在正確的時間 和正確的地點有正確活性,不合適的表達或激活導致細胞的癌變或死亡！,酶的“量變”和“質變”的比較,酶的“量變”,改變酶量的方式有兩種，一種是通過同工酶，另外一種是通過控制酶基因的表達和酶分子的降解。,同工酶,同工酶是指催化相同的反應但性質不同（Vmax和/或Km不同）的酶。它們可能以不同的量出現(xiàn)在一種動物不同的組織或器官，也可能出現(xiàn)在任何真核生物細胞不同的細胞器。例如，高等動物的乳酸脫氫酶（LDH）有五種形式M4、M3H、M2H2、MH3和M4。M4由四個M亞基組成，主要存在于骨骼肌，H4由四個H亞基組成，主要存在于心臟。,乳酸脫氫酶催化的酶促反應,酶的“質變”,別構調節(jié)、共價修飾、水解激活、調節(jié)蛋白的結合和解離以及單體的聚合和解離。,酶活性的別構調節(jié)、共價修飾和水解激活調節(jié)的異同,別構調節(jié),別構調節(jié)的原理在于一些酶除了活性中心以外，還含有所謂的別構中心，該中心能夠結合一些特殊的配體分子（有時為底物）。當別構中心結合配體以后，酶構象發(fā)生改變，從而影響到活性中心與底物的親和力，并最終導致酶活性發(fā)生變化。能夠進行別構調節(jié)的酶稱為別構酶，與別構中心結合調節(jié)酶活性的配體分子稱為別構效應物。起抑制作用的別構效應物稱為別構抑制劑，起激活作用的別構效應物稱為別構激活劑。由底物作為別構效應物產生的別構效應稱為同促效應，否則，就稱為異促效應。許多別構酶具有多個別構中心，能夠與不同的別構效應物結合。 具有協(xié)同效應的酶和無協(xié)同效應的酶都可以受到別構調節(jié)。,酶活性的反饋抑制,別構調節(jié)最多出現(xiàn)在代謝途徑中的反饋抑制，它是指一條代謝途徑（通常是合成代謝途徑）的終產物作為別構抑制劑抑制代謝途徑前面限速酶的活性，因此也被稱為終產物抑制。,齊變學說解釋別構效應物的作用機理,當別構效應物在別構中心與酶結合，誘導酶的構想發(fā)生變化，打破R態(tài)酶和T態(tài)酶之間的平衡。如果是激活劑，則更容易與R態(tài)酶結合，將平衡向左移動，使更多的酶轉變?yōu)镽態(tài)，最終產生激活的效果。如果是抑制劑，則更容易與T態(tài)酶結合，使平衡向右移動，使更多的酶變成T態(tài)，產生抑制效果。,酶活性的別構調節(jié),激活物的存在意味著溶液中有更多的酶處于R態(tài)，這樣就省掉了底物去誘發(fā)T態(tài)向R態(tài)轉變，所以底物協(xié)同效應下降。如果存在大量的激活劑，溶液中幾乎所有