專題五DNA的粗提取與鑒定.ppt

5.1 DNA的粗提取與鑒定,1.通過嘗試對植物或動物組織中的DNA進行粗提取，了解DNA的物理化學性質(zhì)。 2.理解DNA粗提取與鑒定的原理。,課題目標(B),1.提取DNA的方法： （1）DNA的溶解性： 【思考1】DNA在氯化鈉溶液中的溶解度有什么特點？對此有什么應用？ 【思考2】利用什么原理可以來將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離開？,一、基礎知識,DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反,DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質(zhì) 則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。,（2）DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性： 蛋白酶能水解 ，但對 沒有影響； 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受 的高溫，而DNA在 以上才會變性。 能夠瓦解細胞膜，但對DNA沒有影響。 （3）DNA的鑒定： 如何鑒定DNA？,沸水浴條件下，DNA遇二苯胺被染成藍色,根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最??？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？,DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖,在NaCl溶液濃度低于0.14 mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 mol/L時，DNA溶解度最??；當NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。,如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？,當氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL時，DNA的溶解度比較大，濃度為 014 molL時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。,（一）實驗材料的選取,（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液,（三）除去濾液中的雜質(zhì)(純化),（四） DNA的析出與鑒定,二、實驗設計,（一）實驗材料的選取,從下列材料中選取23種,原則：,魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大,思考：(1)教材中選取雞血作為實驗材料，有什么優(yōu)點？ (2）獲取的雞血可以直接使用嗎？,一真核生物，DNA都在染色體上二是因為雞血細胞核大，DNA含量豐富，材料易得；三不要去除細胞壁，,不可以， 方法：0.1 g/mL的檸檬酸鈉溶液100 mL，置于500 mL燒杯中，+新鮮的雞血（約180 mL），同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免血液凝結(jié)。,1.必修一學習的質(zhì)壁分離，你還記得方法和原理嗎? 2.雞血細胞溶液：,（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液,加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒沿同一個方向攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。過濾后收集濾液。,方法：一般510 mL的雞血細胞液加入20 mL蒸餾水攪拌5 min。釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應用紗布進行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。,思考：（1）可以用濾紙嗎？ （2）此步驟獲得濾液的成分有哪些？DNA在哪里。,不可以，孔徑太小。需要用到紗布，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)，獲得含有DNA的濾液。,釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應進行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。 DNA在濾液里。,想一想：洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,洗滌劑離子去污劑，能溶解細胞膜，利于DNA釋放 食 鹽NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中,（3）對于動物細胞我們可以利用細胞的滲透壓來破碎細胞，但是很多情況下，人們不得不面對植物材料，那么我們是不是還可以通過加入一定量的蒸餾水來漲破細胞呢？,通過研磨來破碎植物細胞的細胞壁。在研磨的過程中，一般還會加入洗滌劑和食鹽。,經(jīng)研磨可破碎細胞壁，使細胞核內(nèi)的DNA釋放。若研磨不充分，會使提取的DNA量變少，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。,想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？,1. DNA的溶解性,2. DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性,（三）除去濾液中的雜質(zhì),（1）溶解細胞核內(nèi)的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。 方法：在溶液中加入兩倍體積的濃度為2 mol/L的NaCl溶 液，攪拌1 min。注意應沿一個方向攪拌，使DNA充分溶解。 （2） DNA的析出 加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。 方法：實驗中應該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。同時應注意控制加水量，使NaCl溶液的終濃度為0.10.2 mol/L。加水過程一般分三次進行，當總加水量為300 mL左右時，DNA已基本析出。加水太多、溶液過稀，會使DNA分子又重新溶解。 用34層紗布對DNA稀釋液進行過濾，濾去蛋白質(zhì)，收集DNA的黏稠物。如果采用離心法，效果更好。用4 000 r/min轉(zhuǎn)速的離心機，離心15 min，除去上清液(含有蛋白質(zhì))，留下的沉淀物中含有DNA。此時注意觀察DNA黏稠物的顏色。,（3）將DNA黏稠物再溶解，,繼續(xù)用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個方向不停攪拌3 min，使DNA充分溶解，以免損失。用34層紗布進行過濾（或離心），濾去雜質(zhì)，收集含有DNA的濾液。,思考：為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)?,用高濃度的鹽溶液溶解DNA，去除在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去在鹽溶液中的雜質(zhì)。因此通過反復的溶解與析出DNA，就能去除與DNA溶解度不同的雜質(zhì)。,2mol/L,過濾取紗布上的濾物,紗布過濾,再次溶解DNA,2mol/LNaCl溶液,思考：方案二與方案三的原理有什么不同？,方案二利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開 方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離,（四） DNA的析出與鑒定,向濾液中貼壁緩慢加入50mL預冷的體積份數(shù)為95%乙醇，并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌，溶液中會出現(xiàn)DNA絲狀物。,1、DNA的初步純化,思考：為什么加入預冷的酒精？,預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。 1.抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解 2.降低分子運動，易于形成沉淀析出 3.低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂,2. DNA的鑒定：,二苯胺法,在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺變藍。,溶解：在物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5mL，放入絲狀物，用玻璃棒攪拌，使之溶解。 顯色：加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。 設置對照組：在5mL體積的2mol/L的NaCl溶液中加入4mL的二苯胺試劑，置于沸水中加熱5min。,加冷酒精使DNA析出（純化）,冷酒精,DNA的鑒定,方法步驟,加入物質(zhì),目的,1,.,制備雞血細胞液,檸檬酸鈉溶液,2,.,提取雞血細胞細胞核物質(zhì),20 m1,蒸餾水,3,.,溶解細胞核內(nèi)的,DNA,2 mo1,L,的,NaCl,溶液,40,mL,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸餾水,9,.,DNA,的鑒定,B,:,(1),向試管中加入,2mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺試劑,加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固,加速血細胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出,使含DNA的黏稠物被留在紗布上,使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的濾液中的雜質(zhì),提取DNA, A出現(xiàn)藍色 B無變化,真題練習,（2012.18）下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定實驗”的敘述，正確的是 A洗滌劑能瓦解細胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度 B將DNA絲狀物放入二苯胺試劑中沸水浴后冷卻變藍 C常溫下菜花勻漿中有些酶類會影響DNA的提取 D用玻棒緩慢攪拌濾液會導致DNA獲得量減少,（2011.19）在利用雞血進行“DNA的粗提取與鑒定”的實驗中，相關(guān)敘述正確的是 A用蒸餾水將NaCl溶液濃度調(diào)至0.14 mol/L，濾去析出物 B調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分雜質(zhì) C將絲狀物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色 D用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟相同,觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍色說明實驗基本成功，如果不呈現(xiàn)藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新制備,三、課題成果評價,（一）是否提取出了DNA,（二）用不同的實驗材料和方法,（2010.32）(7分)某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動。具體步驟如下： 材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份每份l0 g。剪碎后分成兩組，一組置于20、另一組置于一20條件下保存24 h。 DNA粗提?。?第一步：將上述材料分別放人研缽中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過濾取濾液備用。 第二步：先向6只小燒杯中分別注人10mL濾液，再加人20 mL體積分數(shù)為95的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。,第三步：取6支試管，分別加入等量的2molL NaCl溶液溶解上述絮狀物。 DNA檢測：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅糜诜兴屑訜? min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺,結(jié)果如下表。 分析上述實驗過程，回答下列問題： (1)該探究性實驗課題名稱是 。 (2)第二