GB5413.25-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.252010中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定 National food safety standard Determination of inositol in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.252010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5413.25-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 肌醇的測(cè)定。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5413.25-1997相比，第一法主要變化如下： 對(duì)菌種保藏培養(yǎng)基進(jìn)行了糾正； 試樣處理由鹽酸蒸餾法改為鹽酸高壓水解法； 菌種接種方式由菌液與培養(yǎng)基混合后分裝試管改為菌液向試管中滴加法； 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度做了調(diào)整； 滅菌溫度由100 調(diào)整為121 ； 明確了控制接種菌懸液濃度的要求和方法； 提高了計(jì)算公式的適用性； 增加了檢出限。 第二法主要變化如下： 采用肌醇硅烷化衍生法； 增加了檢出限。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.25-1997。 GB 5413.252010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 第一法 微生物法 3 原理 利用葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum）對(duì)肌醇的特異性和靈敏性，定量測(cè)定出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。在含有除待測(cè)物質(zhì)以外所有營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長(zhǎng)與待測(cè)物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水。 4.1 菌株：葡萄汁酵母菌（Saccharomyces uvarum），ATCC 9080。 4.2 肌醇（myo-Inositol）標(biāo)準(zhǔn)品：分子式 C6H12O6，純度99 %。 4.3 氯化鈉（NaCl）。 4.4 氫氧化鈉（NaOH）。 4.5 培養(yǎng)基 4.5.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar）：參見(jiàn)附錄 A。 4.5.2 肌醇測(cè)定培養(yǎng)基：參見(jiàn)附錄 A。 4.6 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝試管，每管 10 mL。121滅菌 15 min。 4.7 鹽酸（1 mol/L）：量取 82.0 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。 4.8 鹽酸（0.44 mol/L）：量取 36.6 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。 4.9 氫氧化鈉溶液（600 g/L）：稱取 300 g 氫氧化鈉溶解于水中，冷卻后定容至 500 mL。 4.10 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取 40 g 氫氧化鈉溶解于水中，冷卻后定容至 1000 mL。 GB 5413.252010 2 4.11 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 4.11.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.2 mg/mL）：肌醇標(biāo)準(zhǔn)品置于裝有五氧化二磷的干燥器中干燥 24 h 以上，稱取 50 mg 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（4.2）（精確到 0.1 mg），用水充分溶解，定容至 250 mL，貯存于冰箱中。 4.11.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 g/mL）：吸取 5 mL 肌醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4.11.1）用水定容到 100 mL，貯存于冰箱。 4.11.3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 g/mL 和 2 g/mL）：吸取 10 mL 肌醇標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.11.2）兩次，分別用水定容到 100 mL 和 50 mL。該工作液需每次臨用前配制。 4.12 干燥劑：五氧化二磷（P2O5）。 4.13 玻璃珠：直徑約 5 mm。 5 儀器和設(shè)備 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 5.1 天平：感量為 0.1 mg。 5.2 pH 計(jì)：精度0.02。 5.3 分光光度計(jì)。 5.4 渦旋混合器。 5.5 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.6 恒溫培養(yǎng)箱：30 1 。 5.7 振蕩培養(yǎng)箱：30 1 ，振蕩速度 140 次/min160 次/min。 5.8 冰箱：2 5 。 5.9 無(wú)菌吸管：10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器或吸頭。 5.10 瓶口分液器：0 mL10 mL。 5.11 錐形瓶：200 mL。 5.12 容量瓶（A 類）：100 mL ，250 mL， 500 mL。 5.13 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。 5.14 漏斗：直徑 90 mm。 5.15 定量濾紙：直徑 90 mm。 5.16 試管：18 mm 180 mm。 注：玻璃儀器使用前，用活性劑對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 6.1 接種菌懸液的制備 GB 5413.252010 3 6.1.1 菌種復(fù)蘇 將菌株（4.1）活化后接種到麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基（4.5.1）上，30 1 培養(yǎng) 16 h24 h 后，再轉(zhuǎn)接 2 代3 代來(lái)增強(qiáng)活力，制成貯備菌種，貯于冰箱（8.5）中，保存期不要超過(guò) 2 周。臨用前接種到新的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上。 6.1.2 接種菌懸液的制備 在使用的前一天將貯備菌種轉(zhuǎn)接到新配制的麥芽浸粉瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于 30 1 培養(yǎng) 16 h24 h。 用接種環(huán)刮取菌苔到一支滅菌氯化鈉溶液 （4.6） 試管中。 以 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 2 min3 min，傾出上清液，加入 10 mL 氯化鈉溶液（4.6） ，振蕩混勻，再離心 2 min3 min，如此清洗 3 次4 次。吸取一定量的該菌液移入裝有 10 mL 氯化鈉溶液（4.6）的試管中，制成接種菌懸液。 用分光光度計(jì)，以氯化鈉溶液（4.6）作空白，550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定該接種菌懸液的透光率，調(diào)整加入的菌液量或者加入一定量的氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在 60 %80 %。 6.2 試樣的處理 6.2.1 稱取約含肌醇 0.5 mg2.0 mg 的試樣（精確至 0.1 mg）于 250 mL 三角瓶中，對(duì)于干粉試樣加入 80 mL 鹽酸（4.8），對(duì)于液體試樣加入 100 mL 鹽酸（4.8），混勻，使干粉試樣溶解。 6.2.2 將三角瓶以鋁箔紙覆蓋，在滅菌釜中 125 消化 1 h。取出，冷卻至室溫，加入約 2 mL 氫氧化鈉溶液（4.9），冷卻。用氫氧化鈉溶液（4.10）或鹽酸溶液（4.7）調(diào) pH 至 5.2，轉(zhuǎn)入 250 mL 容量瓶中，定容至刻度?；靹?，過(guò)濾，收集濾液，該濾液為待測(cè)液。調(diào)整稀釋度，使待測(cè)液肌醇的濃度在1 g/mL10 g/mL 范圍內(nèi)。 6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.11.3）和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基（4.5.2）于培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號(hào) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸餾水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液 1 g/mL（mL） 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 肌醇標(biāo)準(zhǔn)工作液 2 g/mL（mL） 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待測(cè)液的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、待測(cè)液（6.2.2）和肌醇測(cè)定培養(yǎng)基（4.5.2）于培養(yǎng)管中，一式三份。 表2 待測(cè)液的制作 試管號(hào) 1 2 3 4 蒸餾水（mL） 4 3 2 1 待測(cè)液（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 6.5 滅菌 GB 5413.252010 4 每支試管內(nèi)加入一粒玻璃珠（4.13） ，蓋上試管帽，121 滅菌 5 min（商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌） 。 6.6 接種 將上述試管迅速冷卻至 30 以下。用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約 50 L）接種菌懸液（6.1.2） ，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中的接種空白試管 S1 除外。 6.7 培養(yǎng) 將試管固定在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，用約 140 次/min160 次/min 的振蕩速度，在 30 1 振蕩培養(yǎng)22 h24 h。 6.8 測(cè)定 對(duì)每支試管進(jìn)行視覺(jué)檢查，接種空白試管 S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無(wú)效。 6.8.1 從振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)取出試管，放入滅菌釜內(nèi)，100 保持 5 min，使微生物停止生長(zhǎng)。 6.8.2 用接種空白試管 S1（6.3）作空白，將分光光度計(jì)透光率調(diào)到 100 %（或吸光度 A 為 0），讀出接種空白試管 S2（6.3）的讀數(shù)。再以接種空白試管 S2 為空白，調(diào)節(jié)透光率為 100 %（或 A 為 0），依次讀出其他每支試管的透光率（或吸光度 A）。 6.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)為 540 nm660 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出透光率，每支試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。以肌醇標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，透光率為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.8.4 根據(jù)待測(cè)液的透光率， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測(cè)液中肌醇的濃度， 再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計(jì)算出試樣中肌醇的含量。透光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S3S10 范圍的試樣管要舍去。 6.8.5 對(duì)每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的試管， 用每支試管的透光率計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液肌醇的濃度， 并計(jì)算該編號(hào)待測(cè)液的肌醇濃度平均值，每支試管測(cè)得的該濃度不得超過(guò)該平均值的15 %，超過(guò)者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有的四個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的總管數(shù)的 2/3，用于計(jì)算試樣含量的數(shù)據(jù)是不充分的, 需要重新檢驗(yàn)。如果符合要求的管數(shù)超過(guò)原來(lái)管數(shù)的 2/3，重新計(jì)算每一編號(hào)的有效試樣管中每毫升測(cè)定液肌醇含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號(hào)試樣管的總平均值 Cx，用于計(jì)算試樣中的肌醇含量。 注： 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，既可讀取透光率（T %） ，也可讀取吸光度（A） 。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中肌醇的含量按式(1)計(jì)算： 1001000=fmCXx(1) 式中： X試樣中肌醇的含量，單位為毫克每百克（mg/100 g） ； Cx6.8.5 中計(jì)算所得的總平均值，單位為微克（g） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； f稀釋倍數(shù)。嬰幼兒食品和乳品 f 為 250。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 8 精密度 GB 5413.252010 5 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。 第二法 氣相色譜法 9 原理 試樣中的肌醇用水和乙醇提取后，與硅烷化試劑衍生，正己烷提取，經(jīng)氣相色譜分離，外標(biāo)法定量。 10 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 10.1 無(wú)水乙醇(C2H6O)。 10.2 正己烷(C6H14)。 10.3 乙醇（95 %）。 10.4 乙醇（70 %）。 10.5 三甲基氯硅烷(C3H9ClSi)。 10.6 六甲基二硅胺烷(C6H19NSi2)。 10.7 N，N-二甲基甲酰胺(C3H7NO)。 10.8 硅烷化試劑：分別吸取體積比為 1：2：8 的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，超聲混勻，臨用前配制。 10.9 肌醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度99 %。 10.10 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.010 mg/mL）：稱取 100 mg（精確至 0.1 mg）經(jīng)過(guò) 105 1 烘干 2 h 的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（10.9）于 100 mL 容量瓶中，用 25 mL 水溶解完全。用乙醇（10.3）定容至刻度，混勻。取 1 mL 此溶液于 100 mL 容量瓶中，用乙醇（10.4）定容至刻度，混勻。 11 儀器和設(shè)備 11.1 天平：感量為 0.1 mg。 11.2 氣相色譜儀，帶 FID 檢測(cè)器。 11.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速5000 轉(zhuǎn)/分鐘。 11.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 11.5 超聲波清洗器。 11.6 恒溫?zé)崴〔邸?11.7 帶有羅紋蓋的 25 mL 試管。 12 分析步驟 GB 5413.252010 6 12.1 試樣處理與衍生 12.1.1 試樣處理： 固體試樣混合均勻后稱取 1 g （精確至 0.0001 g） ， 于 50 mL 容量瓶中， 加入 12 mL約 40 溫水溶解試樣；液體試樣直接稱取 12 g（精確至 0.0001 g）于 50 mL 容量瓶中。上述試樣超聲提取約 10 min，用乙醇（10.3）定容至刻度，混勻。靜置約 20 min 后，取 10 mL 于 15 mL 離心管中，以不低于 4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心約 5 min。取上清液 5 mL 于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮瓶中。 12.1.2 干燥與衍生：向濃縮瓶中加入 10 mL 無(wú)水乙醇（10.1），在 80 2 下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干時(shí)再加入 5mL 無(wú)水乙醇（10.1）繼續(xù)濃縮至徹底干燥（有水將使下步硅烷化不徹底）。加入硅烷化試劑（10.8）10 mL，超聲溶解 5 min 并轉(zhuǎn)移至 25 mL 有螺紋蓋的離心管中，放于 80 2 水浴中衍生反應(yīng)約 75 min，期間每隔約 20 min 取出震蕩一次，然后取出冷卻至室溫。加入 5mL 正己烷（10.2），振蕩混合后靜止分層。取上層液 3 mL 于預(yù)先加少許無(wú)水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中，振蕩后以不低于4000 轉(zhuǎn)/分鐘離心，此為試樣測(cè)定液。 12.2 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的制備 分別吸取 0.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，6.0 mL，8.0 mL，10.0 mL 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.10）于濃縮瓶中，按 12.1.2 步驟操作。 12.3 測(cè)定 12.3.1 參考色譜條件 色譜柱： 填料為 50 %氰丙基-甲基聚硅氧烷的毛細(xì)管柱 （柱長(zhǎng) 60 m, 內(nèi)徑 0.25 mm，膜厚 0.25 m）或同等性能的色譜柱。 進(jìn)樣口溫度：280 。 檢測(cè)器溫度：300 。 分流比：10：1。 進(jìn)樣量：1.0 L。 程序升溫見(jiàn)表 3： 表 3 程序升溫 升溫速率（/ min） 溫度（） 持續(xù)時(shí)間（min） 120 0 10 190 50 10 220 3 12.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定液（12.2）注入到氣相色譜儀中（色譜圖參見(jiàn)附錄 B） ，以測(cè)得的峰面積（或峰高）為縱坐標(biāo)，以肌醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液中肌醇的含量為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 12.3.3 試樣溶液的測(cè)定 分別將試樣測(cè)定液（12.1.2）注入到氣相色譜儀中得到峰面積（或峰高） ，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣測(cè)定液中肌醇的含量（mg）。 13 分析結(jié)果的表述 試樣中肌醇含量按式(2)計(jì)算： 100=iismfCX(2) GB 5413.252010 7 式中： X試樣中肌醇含量，單位為毫克每百克（mg/100 g） ； Cs從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得試樣測(cè)定液肌醇的含量，單位為毫克（mg） 。 mi試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。 fi試樣測(cè)定液所含肌醇換算成試樣中所含肌醇的系數(shù)為 10。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 14 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。 15 其他 本標(biāo)準(zhǔn)第一法、第二法檢出限均為 2.0 mg/100 g。 GB 5413.252010 8 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（Malt Extract Agar） A.1.1 成分 麥芽糖 12.75 g， 糊精 2.75 g， 丙三醇 2.35 g， 蛋