HBVcccDNA及其意義.ppt

HBVcccDNA及其意義,貴州省人民醫(yī)院感染科 湯正明,2006-08-15,1,2006.08.15,感染科,2006-08-15,2,臨床上我們常常遇到以下問題： 慢性乙肝難以治愈 抗病毒治療過程中常常發(fā)生藥物耐受 抗病毒治療后容易復發(fā) 分子生物學研究表明，HBVcccDNA在病毒持 續(xù)感染、抗病毒治療后的再度活躍復制以及藥物耐受方面起著至關重要的作用。 現(xiàn)就 HBVcccDNA乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA的研究進展進行簡單的闡述。這是我的學習匯報，希望各位專家批評指正。,感染科,為什么？,2006-08-15,3,一、HBV感染初期cccDNA的形成 二、HBVcccDNA的穩(wěn)定性 三、核苷類似物不能阻止初始cccDNA的形成 四、HBVcccDNA檢測方法 五、慢性乙肝患者cccDNA檢測的意義 六、如何清除HBVcccDNA？ 七、 cccDNA在抗病毒治療研究中的應用前景,一、HBV感染初期cccDNA的形成,HBVcccDNA存在于肝細胞核內，是病毒成功感染肝細胞的標志，也是慢性乙型肝炎持久存在的關鍵。 其形成過程包括： HBV顆粒與肝細胞膜接觸，被細胞以內吞作用攝入，病毒脫殼后核殼體向肝細胞核轉移，釋放松弛的環(huán)狀DNA（relaxe circular DNA,rcDNA)進入細胞核。,2006-08-15,4,感染科,2006-08-15,5,rcDNA的正鏈在DNA聚合酶作用下進一步延長形成全長的rcDNA，正負鏈末端各自連接并構象發(fā)生改變形成cccDNA，最后在核小體內組合形成非整合狀態(tài)的微型染色體。,感染科,2006-08-15,6,細胞核內的cccDNA作為復制模板轉錄前基因組RNA和其他基因的mRNA。前基因RNA被轉運至胞漿，與病毒核心蛋白以及P蛋白組裝成核殼體。病毒DNA聚合酶具有逆轉錄酶活性，以前基因組RNA為模板逆轉錄子代DNA ，核殼體成熟。,感染科,2006-08-15,7,成熟的核殼體有兩個去向： 部分再進入細胞核重新形成cccDNA，不斷補充核內cccDNA池； 部分進入內質網(wǎng)與病毒蛋白組裝成病毒顆粒向細胞外分泌，感染新的肝細胞。 病毒cccDNA的產生也有兩個途徑，既可由肝細胞內已有的病毒在復制周期中產生，也可由新感染的肝細胞產生。如圖所示。,感染科,2006-08-15,8,感染科,2006-08-15,9,感染科,HBV復制過程,2006-08-15,10,感染科,2006-08-15,11,復制方式： HBV吸附 cccDNA 轉 2.1KbmRNA 外衣殼蛋白 錄 內衣殼蛋白 3.5KbmRNA （前基因組） 反轉錄HBVDNA負鏈 復制+DNA 組裝與釋放,感染科,2006-08-15,12,動物實驗證實，處于穩(wěn)定感染的肝細胞內大約有30-50個cccDNA拷貝。對慢性乙型肝炎患者肝組織內cccDNA實時定量檢測，平均每個感染細胞含有33拷貝，與動物實驗結果相符。 穩(wěn)定感染的肝細胞核內cccDNA一般維持在一定水平，既滿足病毒復制需要，又不對細胞產生毒性。,感染科,2006-08-15,13,這一調節(jié)機制通過病毒胞膜蛋白負反饋機制來實現(xiàn)，前C區(qū)蛋白發(fā)生變異可導致cccDNA大量擴增，并引起細胞死亡。 cccDNA的穩(wěn)定對維持細胞的長期感染狀態(tài)起決定作用。,感染科,2006-08-15,14,cccDNA和rcDNA在結構和理化特性上有3點不同： 1.rcDNA在正鏈與負鏈上均有缺口或缺刻，只是部分區(qū)域互補才能形成環(huán)狀結構，但非超螺旋結構，而cccDNA兩條鏈均是完整的，兩者共價互補，形成超螺旋結構。,感染科,2006-08-15,15,2.rcDNA 能與蛋白共價結合，cccDNA則不能。 3.由于缺口或缺刻的存在，rcDNA 可以被一些核酸酶降解成核苷酸或單核苷酸，而cccDNA則由于是超螺旋且雙鏈結構均完整，一般不會被上述酶降解。,感染科,二、 HBVcccDNA的穩(wěn)定性,對HBVcccDNA半衰期的認識來自動物實驗。核苷類似物可以抑制胞漿內病毒DNA的逆轉錄，從而阻斷胞漿內病毒DNA進入細胞核內再形成cccDNA，使人們可以在動物實驗模型中研究cccDNA半衰期。,2006-08-15,16,感染科,2006-08-15,17,Addisson研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定、雙脫氧鳥苷前體聯(lián)合抗病毒治療能有效抑制DHBV的復制，1周后斑點雜交法檢測表明，血清DHBVDNA下降至檢測水平以下，肝組織中cccDNA呈指數(shù)下降，其半衰期為35-57天。,感染科,2006-08-15,18,Moraleda等通過土撥鼠原代細胞抗病毒研究結果顯示，cccDNA 的半衰期很長，其清除依賴于感染細胞的死亡。 但是也有相反的報道。 盡管用人的原代肝細胞感染HBV，可以觀察到cccDNA的合成和緩慢增加，但到目前為止還沒有原代人肝細胞中cccDNA的半衰期的報道。,感染科,三、核苷類似物不能阻止 初始cccDNA的形成,Delmas等研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋能降低培養(yǎng)細胞內DHBVDNA(包括cccDNA)水平，說明病毒感染后起始的病毒基因組向cccDNA的轉換在阿德福韋存在的情況下仍能發(fā)生，但擴增合成cccDNA的過程被抑制。,2006-08-15,19,感染科,2006-08-15,20,Kock等研究發(fā)現(xiàn)，阿德福韋、拉米夫定都可以部分抑制病毒感染后初始的cccDNA 轉換，前者作用更強，但是，即使聯(lián)合用藥也不能完全抑制初始cccDNA 的轉換。 因此，說明抗病毒藥物治療期間HBV仍有能力感染新的肝細胞，給抗病毒治療帶來困難，因而對慢乙肝患者需要長期使用抗病毒藥物治療。,感染科,四、HBVcccDNA檢測方法,1.細胞內cccDNA的抽提與純化 最常用的抽提細胞內cccDNA的方法是蛋白質去污劑沉淀法，其原理是基于rcDNA和cccDNA與蛋白質結合能力的差異。rcDNA能與蛋白質共價結合，與絕大多數(shù)細胞染色體DNA一起形成沉淀，而cccDNA不能與蛋白質結合故游離于上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNA。根據(jù)繆曉輝等的經驗，該方法的主要缺點是：抽提較為費時，一般需要4-5小時；酚氯仿抽提環(huán)節(jié)多、得率不高；對于凍存的富集細胞（pellet）難以充分裂解，單裂解這一步可能需要3-4小時甚至更長時間。此外，在上清中實際仍然含有少量的rcDNA，而在沉淀中實際上也存在著一部分cccDNA。,2006-08-15,21,感染科,2006-08-15,22,為進一步分離cccDNA、rcDNA和單鏈DNA，可以對抽提產物進行純化。以酶切法最為常用。外切核酸酶是一種35外切酶，對帶有鈍端、5突出端或有缺口的雙鏈具有特異性，而不能降解帶有3突出端（至少4個堿基）的雙鏈DNA。綠豆核酸酶則以內切方式降解單鏈DNA或RNA，而保持雙鏈DNA的完整性（二者的比活性1000），可用于選擇性切除雙鏈DNA的突出單鏈末端，以及切除單鏈DNA或RNA。也可單用綠豆核酸酶酶切rcDNA，或先用外切核酸酶將rcDNA降解成單鏈，然后再用綠豆核酸酶酶切。,感染科,2006-08-15,23,該方法也有其缺點：如抽提產物被稀釋，降低了檢測敏感度；綠豆核酸酶的反應緩沖液對PCR反應有抑制作用等。 繆曉輝等嘗試用小量質粒抽提試劑盒抽提去抽提HepG2.2.15細胞內的cccDNA，結果發(fā)現(xiàn)得率比上述所用方法均要高，操作也簡便，所有操作在30分鐘內就可完成。,感染科,2006-08-15,24,2 .cccDNA的定性檢測 既往絕大多數(shù)文獻報道的是用Southern blot對cccDNA進行定性檢測，該方法是分子生物學的經典方法，但技術要求較高，敏感度低。,感染科,2006-08-15,25,近年來，也有較多文獻報道用PCR技術對cccDNA進行檢測。但是，由于PCR技術靈敏度極高，rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用PCR技術檢測cccDNA時，必須確保只能擴增cccDNA而rcDNA不被擴增。目前利用rcDNA和cccDNA結構上的差異可以解決這一問題。由于rcDNA的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可以設計跨越兩個缺口的引物，使rcDNA不會被擴增，而cccDNA由于是完整的雙鏈結構則可以被選擇性擴增。同時可設計另一對不跨越缺口的引物或只跨越一條鏈的缺口的引物同時檢測cccDNA和rcDNA圖1。Kock等成功地用這種選擇性PCR的方法在檢測感染細胞內的cccDNA和rcDNA。,感染科,2006-08-15,26,此外，為進一步提高檢測的靈敏度，可用套式PCR(nested PCR)的方法。,感染科,2006-08-15,27,感染科,2006-08-15,28,但是有報道認為跨缺口引物對兩種DNA的選擇性不是絕對的，在PCR檢測cccDNA時，起始模板量不能過高，否則rcDNA也有可能被擴增，Kock等發(fā)現(xiàn)每個PCR反應管中HBV DNA的量在1 pg（約6105拷貝）時能達到最佳的靈敏度與選擇性，因此在分析前應估計標本中HBV DNA的量。雖然套式PCR更為靈敏，但由于需取PCR產物進行再次擴增，因此在操作中要注意防止PCR產物污染，避免假陽性。,感染科,2006-08-15,29,3 .cccDNA的定量檢測 在定性檢測的基礎上，可以進一步對cccDNA進行定量檢測。仍以PCR定量分析技術中，尤其是競爭PCR技術的敏感性和精確度高。方法是在PCR反應管中加入一種已知量的、能與野生模板等效擴增的內參照，內參照是經過突變處理的，其兩端尤其是引物退火區(qū)的序列與野生模板相同。PCR擴增后通過一定的方法將野生片段與突變片段區(qū)分開，分別計算其絕對量，或求出其相對比值，就可以推算PCR擴增以前野生模板的量。,感染科,2006-08-15,30,He等建立了實時熒光定量PCR檢測cccDNA的方法。他們將Taqman MGB探針設計在負鏈缺刻的下游，與負鏈互補結合。對cccDNA，在上游引物的引導下，Taq酶到達Taqman MGB探針所結合的位點，利用其53外切活性將探針切斷，3端的淬滅基團失去對5端的發(fā)光基團的抑制作用，從而產生熒光信號。每擴增一個cccDNA分子，就會產生一個熒光信號，PCR儀可對產生的信號進行實時監(jiān)測，根據(jù)熒光信號的強弱對cccDNA進行定量。對rcDNA，由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負鏈缺刻，故不能使Taqman MGB探針被Taq酶切斷產生熒光信號。該方法的特異性比選擇性PCR進一步提高，可以消除高rcDNA背景可能產生的非特異性擴增。該方法的檢測低限可達100個拷貝，靈敏度比目前應用的任何一種其它方法都高。所有檢測在2小時內可完成。,感染科,2006-08-15,31,還有其他一些更為敏感的檢測方法，如Shao等報告的兩步法對cccDNA進行實時熒光定量。其設計與He等的方法有異曲同工之處，即都是利用rcDNA與cccDNA分子結構上是否完整來有效地將二者區(qū)分開來，實現(xiàn)對cccDNA的特異性檢測。,感染科,2006-08-15,32,該方法在熒光探針位置的選擇上更符合熒光PCR的要求，即探針越靠近引物效果越好，這樣檢測到的熒光信號質量和實時擴增曲線形狀可能更佳，而在He等的方法中探針與上游引物點之間的距離則至少需要在230個堿基以上。但是，該方法存在與套式PCR類似的缺點，即需要分兩步操作，單鏈延伸反應管開蓋后極有可能造成產物污染。,感染科,五、慢性乙肝患者 cccDNA檢測的意義,第一，cccDNA可作為評價抗乙肝病毒藥物的新指標。 目前臨床上評價干擾素、核苷類似物這些抗乙肝病毒藥物時存在一個很大的問題。 即其評價指標主要是患者肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA水平的變化以及肝組織的病理學改變等。,2006-08-15,33,感染科,2006-08-15,34,誠然，這些指標對臨床醫(yī)師判斷患者病情而言非常重要和實用，也是臨床醫(yī)師選用抗乙肝病毒藥物時的依據(jù)。 然而對于何時停用抗病毒藥物、停用抗病毒藥物后乙肝病毒是否會重新復制活躍導致乙肝復發(fā)，則缺乏客觀而有效的指標。,感染科,2006-08-15,35,開展肝細胞內乙肝病毒cccDNA的動態(tài)定量監(jiān)測可以部分解決這個問題。 治療前后肝細胞內乙肝病毒cccDNA含量的變化應該納入到抗乙肝病毒藥物評價的指標體系中來，從一定意義上說，只有能夠徹底清除乙肝病毒cccDNA的藥物，才能算是真正“有效”的抗病毒藥物。,感染科,2006-08-15,36,第二，檢測乙肝病毒cccDNA可作為評價乙肝病毒是否能感染肝外組織的客觀指標之一。乙肝病毒不僅僅是一種嗜肝病毒，一些肝外組織中也可檢測到乙肝病毒DNA，如腎臟、胰腺以及外周血單個核細胞(PBMC)等。 早就有人發(fā)現(xiàn)乙肝病毒可以感染白細胞,而這種免疫細胞的感染似乎有利于病毒逃避免疫反應，從而導致機體清除乙肝病毒的能力下降。關于PBMC能否被乙肝病毒感染的問題目前仍有爭議，其中一個重要的原因是沒有確立PBMC被感染的標準。 我們認為把PBMC細胞內是否存在cccDNA作為判斷感染的標準是最可靠的。 cccDNA的形成是乙肝病毒的侵入細胞后在細胞內進行復制的起始步驟，也是轉錄合成前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的前體，是建立病毒感染狀態(tài)的最重要標志，沒有cccDNA的形成也就沒有其后的一系列過程。,感染科,2006-08-15,37,Kock等用乙肝病毒去感染體外培養(yǎng)的PBMCs時，發(fā)現(xiàn)不能在細胞內檢測到cccDNA，相反，如果轉染的是肝細胞，則非常容易檢測到cccDNA。此外，在乙肝患者的肝組織內，能檢測到cccDNA和rcDNA，而在其PBMC中，則只能檢測到rcDNA。,感染科,2006-08-15,38,認為乙肝病毒是不能感染PBMC，即使PBMC中檢測到乙肝病毒，也只是血液的病毒DNA與PBMC表面牢固結合，不易被PBS等洗滌下來，抽提細胞所得到的病毒DNA其實并不存在于細胞內；或病毒僅僅是被PBMC所“吸收”(absorption)，并沒有建立真正意義上的感染狀態(tài)。 這一實驗結果給我們很多啟發(fā)，也加深了對乙肝病毒感染的認識。,感染科,2006-08-15,39,第三，檢測乙肝病毒cccDNA可評價乙肝患者病情?？姇暂x等用選擇性熒光定量PCR對93例乙肝患者血清作回顧性分析時，發(fā)現(xiàn)24例患者血清HBVcccDNA呈陽性，其中慢性乙肝中度以上的病例占70%以上。,感染科,2006-08-15,40,繆曉輝等用選擇性熒光定量PCR對93例乙肝患者血清作回顧性分析時，發(fā)現(xiàn)24例患者血清cccDNA呈陽性，其中急性乙肝1例，慢性乙肝（輕度）6例，慢性乙肝（中度）6例，慢性乙肝（重度）3例，肝炎肝硬化2例，慢性乙肝（重型）6例，其中慢性乙肝（中度）以上的病例占70%以上。雖然經過統(tǒng)計學分析還不能看出顯著差異，樣本量還不夠大，血清cccDNA陽性與病情的輕重是否存在某種關系還有待于進一步的深入研究。但是，從理論上推測，既然存在于肝細胞胞質和線粒體中的轉氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內的cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多，對于同一個患者而言，在某一時間段內，其血液中的cccDNA水平應該也相應地越高，對判斷病情有意義。,感染科,2006-08-15,41,雖然經過統(tǒng)計學分析還不看出顯著差異，樣本量還不夠大，血清HBVcccDNA陽性與病情的輕重是否存在某種關系還有待于進一步的深入研究。 目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測血液中的cccDNA的動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。當然，其中還存在一些問題有待研究和解決，比如血液中的cccDNA水平遠遠低于肝組織中的cccDNA水平，也遠遠低于血液中的的rcDNA水平，因此必須進一步提高cccDNA定量檢測的靈敏度。,感染科,2006-08-15,42,但是，從理論上推測，既然存在于肝細胞胞質和線粒體中的轉氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內的cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多，對于同一例患者而言，在某一時間段內，其血液中的cccDNA水平應該也相應地越高，對判斷病情有意義。,感染科,2006-08-15,43,目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測血液中cccDNA的動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。,感染科,2006-08-15,44,當然，目前還存在一些問題有待研究和解決，例如血液中HBVcccDNA的水平遠遠低于肝組織中的水平，也遠遠低于血液中的松