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專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,一、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),(一)培養(yǎng)基,人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求,配置出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱,培養(yǎng)基,一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水等(具體見教材15頁(yè)“100mL牛肉蛋白胨培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成”)。,培養(yǎng)基的基本成分,液體培養(yǎng)基(一般用錐形瓶盛裝) 固體培養(yǎng)基(一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝),在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂。,培養(yǎng)基的種類,(二)無(wú)菌技術(shù),無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中,所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。,獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵,無(wú)菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。,消毒,無(wú)菌技術(shù)的種類,滅菌,使用較為溫和的方法(酒精、紫外線)來(lái)殺死部分對(duì)人體有害的微生物。,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒; 將培養(yǎng)皿、接種用具進(jìn)行滅菌; 接種的過(guò)程要在酒精燈附近進(jìn)行。,使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物(包括芽孢和孢子)。,1.灼燒滅菌:接種用具和接種過(guò)程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進(jìn)行灼燒滅菌(如教材16頁(yè)圖2-2所示)。,常用的消毒與滅菌的方法,2.干熱滅菌:將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi),在160170OC中加熱12h即可。,3.高壓蒸汽滅菌:將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)(見教材16頁(yè)圖2-4)煮沸,待冷空氣排盡后,密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa,溫度到121OC后,維持1530min即可。,二、實(shí) 驗(yàn) 操 作,(一)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方,2.稱量 按比例稱取各種物質(zhì),注意事項(xiàng):牛肉膏要放在稱量紙上稱量,牛肉膏、蛋白胨都易吸潮,稱取時(shí)動(dòng)作要迅速,稱后及時(shí)蓋上瓶蓋。,3.溶化:先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯,加少量水,加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后,用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉,用玻璃棒攪拌使之溶解,再加入瓊脂,攪拌,待溶解后,加自來(lái)水定溶至100mL。,4.滅菌:將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中(瓶口加棉塞,包上牛皮紙),連同培養(yǎng)皿(35套,用幾層報(bào)紙包好)一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。,5.倒平板:待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時(shí)倒平板(如教材17圖示)。,倒平板操作的討論,1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時(shí)倒平板。用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度? 用手觸摸錐形瓶,溫度下降到剛剛不燙手時(shí)即可開始倒平板。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰? 通過(guò)灼燒滅菌,防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置? 平板冷凝后,皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠,凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高,將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染。,4.在倒平板的過(guò)程中,如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎?為什么? 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生,因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,(二)純化大腸桿菌,微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。,1.平板劃線法 通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面(操作如教材18頁(yè)圖示)。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。,1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)?,操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后,接種環(huán)上殘留的菌種,使下一次劃線時(shí),接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端,從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加,使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少,以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán),能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種,避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,平板劃線法的討論,2.在灼燒接種環(huán)之后,為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線? 以免接種環(huán)溫度太高,殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí),為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線? 劃線后,線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少,每次從上一次劃線的末端開始,能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少,最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。,2.稀釋涂布平板法 將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。 稀釋涂布平板法操作過(guò)程分兩個(gè)步驟,即系列稀釋操作和涂布平板操作。,系列稀釋操作,101,102,103,104,105,106,(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號(hào)。,(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液,注入第二支試管中,輕壓橡皮頭,吹吸三次使之充分混勻。,(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液,注入第三支試管中,重復(fù)步驟2,直至到第六支試管。,涂布平板操作,(1)將涂布器浸在盛有70的酒精的燒杯中。,(2)取少量菌液(不超0.1mL),滴加到培養(yǎng)基表面。,(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃,火熄后冷卻810s。,(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。,涂布平板操作討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求,想一想,第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作? 應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如,酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。,將接種后和未接種(作為對(duì)照組)的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中,培養(yǎng)1224h后進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果。,三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)?如果有菌落生長(zhǎng),說(shuō)明了什么? 未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無(wú)菌落生長(zhǎng),說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的,否則需要重新制備。,2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上,能否觀察到獨(dú)立的菌落?它們的大小、形狀、顏色相似? 如果接種成功的話,在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。,3.培養(yǎng)12h和24h后,觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎?如果不同,請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因? 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌落的不斷生長(zhǎng),使菌落不斷增大。,4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落,請(qǐng)分析其可能的原因。 無(wú)菌操作未達(dá)到要求:可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底;可能是接種時(shí)發(fā)生了污染;也可能是在培養(yǎng)的過(guò)程中受到了污染。,四、課題延伸菌種的保存,1.試管低溫臨時(shí)保存 將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)成菌落后,置于4OC的冰箱中保存(每隔36個(gè)月要重新接種培養(yǎng)后再保存)。,2.甘油管長(zhǎng)期保存 在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油,高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中,充分混合后,置于20OC的冷凍箱中保存。,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),(一) 篩 選 菌 株,原理 人為提供有利于目的菌株的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等),同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 在微生物學(xué)中,將允許特定種類的微生物生長(zhǎng),同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,稱做選擇培養(yǎng)基。,1.在培養(yǎng)基的配方中,為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)?,碳源是葡萄糖,氮源是尿素。,2.分析該配方的培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有篩選作用?如果有,又是如何進(jìn)行篩選的?,能分解尿素的細(xì)菌的篩選 閱讀教材22頁(yè)第一大段相關(guān)內(nèi)容,并思考回答下列問(wèn)題:,有篩選作用,它的氮源只含有尿素,只有能合成分解尿素的脲酶的細(xì)菌才能生長(zhǎng)。,(二) 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,原理 運(yùn)用稀釋涂布平板法來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)。 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是:當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí),培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落,來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此,恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確,通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上,培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30 300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。,第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板,沒(méi)有設(shè)置重復(fù)組,因此結(jié)果不具有說(shuō)服力。第二位同學(xué)設(shè)置了重復(fù)組,涂布了3個(gè)平板,但是,其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另 2個(gè)相差太遠(yuǎn),說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤,因此,不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。 在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),一定要涂布至少3個(gè)平板,作為重 復(fù)組,才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否基本一致,結(jié)果不一致,意味著操作有誤,需要重新實(shí)驗(yàn)。,閱讀教材22頁(yè)“(二)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目”一段,并討論教材中提出的問(wèn)題。,(三) 設(shè) 置 對(duì) 照,A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同,可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同,二是由于培養(yǎng)基污染或培養(yǎng)基混有其它氮源。究竟是哪個(gè)原因,可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以接種其它菌種,看是否有菌落的出現(xiàn),驗(yàn)證培養(yǎng)基是否混有其它氮源。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng),作為空白對(duì)照,以證明培養(yǎng)基是否受到污染。 所以,在實(shí)驗(yàn)中一般都應(yīng)設(shè)置對(duì)照組,使實(shí)驗(yàn)更有說(shuō)服力。,閱讀教材2223頁(yè)“(三)設(shè)置對(duì)照”一段,并討論教材中提出的問(wèn)題。,一、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),閱讀教材2325頁(yè)“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”和“操作提示”等兩個(gè)內(nèi)容,請(qǐng)根據(jù)教材提供的三個(gè)資料、樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖及“操作提示”的有關(guān)問(wèn)題,自行設(shè)計(jì)一個(gè)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)這樣的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),1.實(shí)驗(yàn)名稱,土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模裕?3.材料用具(略),4.操作步驟,從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去(鏟已經(jīng)過(guò)消毒處理)表層土3cm左右,再取樣,將樣品裝入事先滅菌過(guò)的信封中。,(1)土壤取樣,將菌液稀釋(見教材23頁(yè)“樣品稀釋流程示意圖”)。稀釋倍數(shù)為 101 106。每個(gè)稀釋度均用3個(gè)選擇培養(yǎng)基。,(2)樣品稀釋涂布,(3)微生物的培養(yǎng)與觀察,將涂布好的培養(yǎng)皿放在30溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生,做好記錄。,(4)細(xì)菌的計(jì)數(shù),選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下,至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù),然后求出平均值,并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,二、結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng),說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目,說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,2.樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板,則說(shuō)明稀釋操作比較成功,并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,3.重復(fù)組的結(jié)果是否一致,如果各位同學(xué)選取的是同一種土樣,統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn),則需要從各項(xiàng)操作過(guò)程中去分析、尋找可能的原因。,三、課 題 延 伸,能分解尿素的細(xì)菌的鑒定,鑒定的原理: 細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨,會(huì)使培養(yǎng)基的pH升高。 鑒定方法: 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑,利用此培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),觀察培養(yǎng)基的顏色變化。,分解纖維素的微生物的分離,(一)纖維素與纖維素酶,纖維素:一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物,廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。,纖維素酶:由微生物分泌的一種復(fù)合酶,包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,由于它們的協(xié)同作用,最終將纖維素分解成葡萄糖。,纖維素,纖維二糖,葡萄糖,取二支20mL的試管,實(shí)驗(yàn):纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn),各加入一張濾紙條,各加入10mL0.1mol/L的醋酸 醋酸鈉緩沖液,甲 乙,在甲試管中加入1mL蒸餾水,,乙試管加入1mL纖維素酶,將試管放在140r/min的搖床上振蕩1h,結(jié)果:乙試管的濾紙條消失,討論:乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失?甲試管的作用是什么?,剛果紅染色法,剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物,而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。,(二)纖維素分解菌的篩選,用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時(shí),如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時(shí),可說(shuō)明該菌落是纖維素分解菌,因?yàn)樗褜⒈粍?果紅 染成紅色的纖維素分解了。,一、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),請(qǐng)你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作提示”,在思考有關(guān)問(wèn)題的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。,閱讀與思考,閱讀教材2829頁(yè)“資料一”“資料三”,并思考相關(guān)問(wèn)題。,問(wèn)題一:是液體培養(yǎng)基,因?yàn)闆](méi)有添加瓊脂。,問(wèn)題二:具有篩選作用,因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的碳源是纖維素,該培養(yǎng)基只有能分泌纖維素酶的纖維素分解菌才能生長(zhǎng)。,問(wèn)題三:選擇培養(yǎng)基具有篩選、純化微生物的作用。,土壤中纖維素分解菌的分離,1.土樣采集 :土樣采集的方法與本專題課題 2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境,這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境,通常會(huì)聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境,可以將濾紙埋在土壤中,過(guò)一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長(zhǎng)。,二、實(shí) 驗(yàn) 案 例,2.選擇培養(yǎng) : 選擇培養(yǎng)的操作:稱取土樣20 g,在無(wú)菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上,在30 下振蕩培養(yǎng)12 d,至培養(yǎng)基變混濁,重復(fù)上述方法再培養(yǎng)一次,然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。,3.剛果紅染色法分離:常用的剛果紅染色法有兩種,一種是先培養(yǎng)微生物,再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng),另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。,三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落,則說(shuō)明可能獲得了分解纖維素的微生物。,課題延伸,本課題對(duì)分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選。但是,這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌,還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實(shí)驗(yàn)。,1、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 2、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 3、分解纖維素的微生物的分離,DNA重組技術(shù),下列不屬于微生物的是 ( ) A藍(lán)藻和蘑菇 B葫蘆蘚和鐵線蕨 C噬菌體和黃曲霉 D放線菌和變形蟲 【解析】病毒、原核生物(例如細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)藻)、真核類的藻類和真菌及原生動(dòng)物都是微生物。而一般多細(xì)胞的植物與動(dòng)物不屬于微生物,如葫蘆蘚是苔蘚植物,鐵線蕨是蕨類植物,都屬于多細(xì)胞高等植物。 【答案】B,微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中,正確的是( ) A是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B凡碳源都提供能量 C除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽 D無(wú)機(jī)氮源也能提供能量 【解析】不同的微生物,所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別,要針對(duì)微生物的具體情況具體分析。對(duì)于A、B選項(xiàng),它的表述是不完整的。有的碳源只能是碳源,如CO2;有的碳源可同時(shí)是氮源,如NH4HCO3;有的碳源同時(shí)是能源,如葡萄糖;有的碳源同時(shí)是氮源,還是能源,如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng),除水以外的無(wú)機(jī)物種類繁多,功能也多樣。如CO2可作自養(yǎng)型微生

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