生物選修一(考點)資料.doc

秦淮中學2015屆高三生物一輪復習 要點知識與復習導學案選修11：酶的應用一、酶在洗滌等方面的應用【選學（了解）】果膠酶及其應用：1. 果膠酶：是指一類酶的總稱。包括：半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和果膠酯酶。2. 果膠酶的來源：來自霉菌等微生物。常采用霉菌等微生物發(fā)酵的方法生產果膠酶。提取果膠酶的條件：低溫（04）、偏酸環(huán)境（pH：34）、激活劑（10%NaCL）。3. 果膠酶的作用：能分解植物細胞壁及胞間層的果膠。4. 果膠酶的應用：常用于提高果汁的出汁率和澄清度。5. 探究果膠酶作用的最適條件（最適溫度和pH）和用量的實驗要點：遵循單一變量原則和對照實驗原則。以果汁出汁量或澄清度作為判斷酶活性的指標。（一）酶在洗滌方面的應用【A】1. 普通洗衣粉的主要成分：表面活性劑、軟水劑（三聚磷酸鈉）、堿劑、漂白劑、香精等。 表面活性劑：是洗衣粉的核心成分，作用：降低表面張力。 2. 加酶洗衣粉：是指加入了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的洗衣粉。（1）酶不能直接加入洗衣粉，所加的是用特殊化學物質包裹成的復合酶制劑。加入洗衣粉的酶制劑不是固定化酶，其包裹材料能溶于水。加入洗衣粉中的酶來源：基因工程生產的酶。能耐酸、耐堿、耐較高溫度等。（2）加酶洗衣粉降低了表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量。使用加酶洗衣粉不僅能增強了洗滌效果，還能減少對環(huán)境的污染（磷污染）。（3）在洗滌劑中應用最廣泛、效果最明顯的酶是： 堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。3. 酶制劑的洗滌原理：（1）堿性蛋白酶：可將血漬、奶漬等中蛋白質分解成可溶性氨基酸和易脫落小分子多肽。（2）堿性脂肪酶：可將油漬、汗?jié)n和口紅等中的脂肪水解成脂肪酸和甘油等。（3）淀粉酶： 可將面、粥等中的淀粉水解為麥芽糖、葡萄糖等可溶性成分。（4）纖維素酶：本身不能去污垢，但能使纖維結構變得蓬松，利于洗衣粉與纖維深處污垢接觸，增強洗滌效果。纖維素酶能去除衣物浮毛，不會分解衣物纖維素。4. 加酶洗衣粉使用注意事項：（1）不能用于洗滌：毛織品和絲織品等蛋白質類衣物（2）不能用70及其以上水溫洗滌。（適宜水溫：3550；適宜pH：911）。（3）不宜長期存放（酶會失效）。加酶洗衣粉對人的皮膚有腐蝕性，應注意防護。（二）探究加酶洗衣粉洗滌效果實驗【B】1. 觀察指標：（各實驗都是）污物消失時間（或污物縮小的面積）。2. 各對照實驗共有的無關變量：水用量、洗衣粉用量、污物量、布的質地大小、洗滌方式、浸泡和洗滌時間等。3. 比較普通洗衣粉與加酶洗衣粉洗滌效果的實驗： 自變量：洗衣粉種類。 無關變量：除共有的外，還有水溫、pH、洗衣粉品牌。4. 探究不同種類加酶洗衣粉洗滌效果的實驗：自變量：加酶洗衣粉種類。無關變量：除共有的外，還有水溫、pH等。5. 探究使用加酶洗衣粉的最適宜溫度實驗：各組溫度形成自身對照。 （1）自變量：溫度。 無關變量：除共有的外，還有pH等。（2）應在最適溫度左右等梯度設置多組溫度進行對照實驗。溫度梯度越小越準確。6. 探究使用加酶洗衣粉的最適宜pH實驗：各組pH形成自身對照。 （1）自變量：pH。 無關變量：除共有的外，還有水溫等。（2）應在最適pH左右等梯度設置多組pH進行對照實驗。pH梯度越小越準確。二、制備和應用固相酶： （一）固定化酶和固定化細胞技術及其應用【A】：1. 固定化酶：是指用物理學或化學方法將酶與固相載體結合在一起形成的仍具有酶活性的酶復合物。固定化酶可以反復使用，原因是酶與水溶液反應物和產物可以分離。2. 制備固定化酶的主要方法：包括：吸附法、交聯法、包埋法等。交聯法 吸附法 包埋法（1）吸附法：利用離子鍵、物理吸附等方法將酶分子吸附在固相載體的表面。（2）交聯法：利用（雙）多功能試劑進行酶與載體之間交聯，形成三維網狀結構。（3）包埋法：將酶或細胞包埋在不溶于水的多孔載體中。 常用固相載體：海藻酸鈉、纖維素、瓊脂糖、明膠、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等。3.制備固定化酶（細胞）的要求和方法選擇： （1）選擇的固定化方法及材料不能影響酶活性；要避免高溫、強酸、強堿等。（2）制備固定化酶時：常用吸附法和化學結合法，不用包埋法。酶分子小，容易從包埋材料中漏出。（3）制備固定化細胞時：常用包埋法。 不用吸附法和化學結合法。細胞個大，難以吸附或結合，不易從包埋材料中漏出。4. 直接使用酶、固定化酶和固定化細胞的比較：主要優(yōu)點主要缺點直接使用酶催化效率高，耗能低、低污染。不能反復使用，影響產品質量。固定化酶能與產物分離，能反復使用。易與反應物接觸。不能催化系列反應。固定化細胞能與產物分離，能反復使用。能催化系列反應。酶活性高而穩(wěn)定、操作容易，成本更低酶不易與反應物接觸，反應效率降低。只能用于生產胞外酶和分泌到細胞外的產物。5. 固定化酶的應用實例：（1）固定化葡萄糖異構酶：用于生產高果糖漿。見右圖：（2）固定化青霉素酰化酶：用于生產各種新型青霉素。（3）尿糖試紙：測試尿糖。（含量：淺藍淺綠棕色淺棕色）。 尿糖試紙上含固定化葡萄糖酶和過氧化氫酶及無色化合物。 尿糖試紙不能反復使用，因為用過的試紙上有顏色。（4）固定化硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶：進行廢水處理。（二）固定化酵母細胞的制備與應用（實驗）【B】1. 制備固定化細胞常用凝膠包埋法。制備固定化酵母細胞常用海藻酸鈉凝膠包埋法。凝膠是多孔載體，調節(jié)凝膠溶液的濃度，可以改變凝膠的孔徑大小。2. 制備固定化酵母細胞的方法步驟：關鍵步驟：配制海藻酸鈉溶液。（1）活化酵母細胞：目的：使酵母菌從休眠狀態(tài)恢復到正常生活狀態(tài)。 操作：將1克干酵母和10ml蒸餾水放在50ml燒杯中混合并攪拌均勻，放置1小時。 注意事項：容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要進行攪拌。（2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液：操作：將0.83克無水CaCL2和150mL蒸餾水，放在200ml燒杯中使其充分溶解。 CaCL2溶液的作用：（起凝膠聚沉作用）促使凝膠珠的形成。（3）配制海藻酸鈉溶液（最關鍵）： 操作：將0.7g海藻酸鈉和10ml蒸餾水加入50ml小燒杯中，小火間斷加熱至完全溶化，加蒸餾水定容至10ml。注意事項：應采用小火間斷加熱，以防焦糊；海藻酸鈉濃度不宜過高過低。海藻酸鈉溶液濃度過高時：難以形成凝膠珠或凝膠珠形態(tài)異常。海藻酸鈉濃度過低時：凝膠珠中包埋的細胞數量少，凝膠珠色淺呈白色。（4）海藻酸鈉溶液與酵母細胞混合：應將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫后，再加入已活化的酵母細胞；并充分攪拌均勻。（5）固定化酵母細胞：操作：用注射器吸取混合液，以恒定的速度緩慢地滴加到CaCL2溶液中，并不斷攪拌（磁力攪拌器攪拌），將凝膠珠在CaCL2溶液中浸泡30分鐘。注意事項：注射器距液面距離不能太近、凝膠珠浸泡時間不能過短。注射器距液面距離過近時：凝膠珠會出現拖尾現象。凝膠珠浸泡時間過短時：凝膠珠不能形成穩(wěn)定結構，容易裂開。（6）沖洗：取出凝膠珠后，要用蒸餾水沖洗23次。沖洗的目的：洗去凝膠珠表面的氯化鈣溶液和雜菌。（7）發(fā)酵實驗：將10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的錐形瓶中，加入固定化酵母細胞在25下發(fā)酵24h。觀察氣泡產生（CO2）和聞酒味，并用重鉻酸鉀檢測酒精。3. 實驗結果分析：酵母細胞凝膠珠質量檢測。（1）合格凝膠珠的標準：乳白色，圓形或橢圓形。摔打容易彈起。擠壓不易破裂、無液體流出。（2）凝膠珠異常的原因： 色淺呈白色：海藻酸鈉溶液濃度偏低，此種凝膠珠中包埋的酵母細胞數量少。 不呈圓形或橢圓形：海藻酸鈉溶液濃度偏高。此種凝膠珠為制作失敗，不能使用；需要重新制作。 拖尾現象：混合液濃度低，或注射器距氯化鈣溶液液面距離太近。凝膠珠漂?。夯旌先芤褐泻瑲馀?。 凝膠珠容易裂開：凝膠珠在氯化鈣溶液中浸泡時間過短。選修12：生物技術在食品加工中的應用一、發(fā)酵食品加工的基本方法【A】（一）傳統(tǒng)發(fā)酵中所利用的微生物的比較：酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生物類型真核生物原核生物真核生物原核生物代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)厭氧型適宜生長溫度182530351518室溫主要用途釀酒、發(fā)面釀醋制作腐乳制酸奶、泡菜（二）各類發(fā)酵食品的制作原理及方法：1. 制作果酒原理：以果汁為原料，利用酵母菌在無氧條件下（酒精發(fā)酵）產生酒精。（1）自然發(fā)酵：利用附著在葡萄皮上的野生型酵母菌進行酒精發(fā)酵。（2）工業(yè)生產上：用人工培養(yǎng)的純種酵母菌進行酒精發(fā)酵。（3）紅葡萄酒是用帶皮葡萄釀制而成，白葡萄酒是用去皮葡萄釀制而成。（4）果膠酶可用于酒的陳釀化；蛋白酶可使酒體清澈透明。2. 制作果醋原理：以果汁或果酒為原料，利用醋酸菌在有氧條件下產生醋酸。3. 制作腐乳的原理： 利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶將豆腐中的蛋白質、脂肪和淀粉分解為多種氨基酸、有機酸等；使腐乳鮮香可口，易消化吸收。（1）在腐乳制作中，多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，但起主要作用的是毛霉。毛霉是絲狀真菌，其代謝類型屬于異養(yǎng)需氧型；適宜生長溫度：1518。 毛霉孢子分布廣泛，空氣中含有大量毛霉孢子。（2）家庭和實驗制作腐乳時，將豆腐坯暴露在空氣中接種毛霉孢子。（3）工業(yè)生產腐乳時，在嚴格無菌條件下接種優(yōu)良毛霉菌種孢子。腐乳品質好。工業(yè)上生產腐乳步驟：接種孢子。培養(yǎng)和晾花。壓坯與裝壇“晾花”的目的：增強酶的作用，散失霉味。 （4）醉方（添加黃酒制成）、紅方（添加紅曲制成）、青方（不加調料制成）。4. 酸奶和泡菜制作原理：利用乳酸菌在無氧條件下發(fā)酵產生乳酸。（1）泡菜中亞硝酸鹽含量變化規(guī)律：先增加再下降至原含量水平。 （2）泡菜制作要求：壓實和嚴格密封。加鹽量不宜過多過少，控制在5%。（3）食用時間：腌制1011天以后。是否能食用，需要檢測亞硝酸鹽含量。 比色法檢測：將樣品液顯色情況與亞硝酸鈉標準顯色液比較估測出其含量。不同濃度的顯色液呈不同程度的玫瑰紅色。二、果酒和果醋的制作【B】（一）果酒制作：果酒中酒精含量應控制在10%20%。1. 果酒制作方法步驟（及注意事項）： （1）對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機等進行清洗和消毒：發(fā)酵瓶要用溫水反復清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。 （2）取葡萄500克，先沖洗干凈，再去除枝梗和腐爛籽粒，再次沖洗。沖洗目的：去除葡萄表面污物雜物。不能先去枝梗再沖洗。 不能反復沖洗，否則會沖洗掉附著在葡萄表面的野生型酵母菌。 （3）用榨汁機榨取葡萄汁，之后將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶中，并蓋好瓶蓋：【注意】果汁不能裝滿（裝入量不超過發(fā)酵瓶總體積的2/3）。目的是：讓酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保證發(fā)酵時有較大起始數量。 防止發(fā)酵時發(fā)酵液溢出。（4）將發(fā)酵瓶放置在1825條件下發(fā)酵1012天：（5）每天定期排氣12次（排CO2），以防瓶爆裂。 為了防止發(fā)酵瓶爆裂，最好選用塑料瓶。 排氣時要防止雜菌污染，常擰松瓶蓋排氣，不能打開瓶蓋。 右圖發(fā)酵裝置中排氣管設計成長而彎曲狀，既能排氣，又能防止雜菌污染。 （6）取樣檢測酒精（10天后）：用酸化重鉻酸鉀檢測；也可聞酒味、鏡檢酵母菌。【檢測方法】取兩支試管編號1、2，分別裝入2mL酒精、2mL發(fā)酵液。向兩試管中分別滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振蕩混勻。再向兩試管中各加入飽和重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩后觀察溶液顏色變化。2.制作果酒和果醋中防止雜菌污染的措施：（1）對用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。（3）排氣管設計為長而彎曲狀。 （4）無菌操作。（二）果醋制作： 1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋：（1）要向果汁中接種醋酸菌，并置于3035條件下進行有氧發(fā)酵。酶（2）發(fā)酵時需要不斷通入無菌空氣，同時也需要定期排氣（排CO2）。（3）反應式：C6H12O6 2O2 2 CH3 COOH 2CO22 H2O能量2. 利用果酒制作果醋的方法步驟：（1）將醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接種到制作好的果酒中，并通入無菌空氣。（2）將發(fā)酵裝置放在3035環(huán)境中，不斷通入無菌空氣進行有氧發(fā)酵78天。（3）檢測果醋是否制作成功，并對發(fā)酵液（果醋）進行過濾、滅菌：【檢測方法】pH測定、觀察醋酸菌膜形成、聞酸味、品嘗、鏡檢等。【提醒】變酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。酶 泡菜壇內表面白色菌膜是由酵母菌形成的。（4）果酒制果醋反應式： C2H5OH O2 CH3 COOH H2O 能量（三）果酒制作與果醋制作的比較： 果酒制作果醋制作發(fā)酵菌種酵母菌醋酸菌最適發(fā)酵溫度18253035對氧氣需求前期需氧，后期不需氧一直需要氧pH4.05.85.46.3發(fā)酵時間1012天78天方法與流程挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵（果酒）醋酸發(fā)酵（果醋）三、腐乳的制作【A】1. 腐乳制作的基本流程：見下圖：讓豆腐上長出毛霉 直接接種或利用空氣中毛霉孢子，1518培養(yǎng)。 加鹽腌制 逐層加鹽，隨層數增高而增加鹽量；近瓶口處鋪厚些。 加鹵湯裝瓶 鹵湯由酒和香辛料配成。 密封腌制 用酒精燈對瓶口滅菌后密封。（1）讓豆腐上長出毛霉：將豆腐切成小塊（4cm4cm1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。在晾干過程中空氣中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接種過程。所用豆腐含水量應控制在70%左右，含水過多腐乳不成形。將腐乳坯豎立放在清潔容器內彼此間隔1cm，將溫度控制在1518，并保持一定濕度讓毛霉生長；當菌絲變成淡黃色，有大量灰褐色孢子形成時停止發(fā)酵。若某些豆腐上長出青霉，應剔除這種豆腐或重新制作。（2）加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊用食鹽水清洗后整齊地擺放在瓶中，用食鹽腌制10天。加鹽方法：逐層加鹽，加鹽量逐層遞增，接近瓶口的表面鹽要鋪厚一些。鹽量：腐乳坯量= 5 ：1。加鹽過多會影響繼續(xù)發(fā)酵，過少豆腐會腐敗變質?！炯欲}目的】析出豆腐中水分，使豆腐變硬，防止過早酥爛。 抑制微生物生長，防止豆腐腐敗變質。 調節(jié)口味。（3）配制鹵湯：用食鹽、水和料酒及各種香辛料等進行配制。鹵湯中酒含量控制在12%左右。酒的作用：抑制微生物的生長，并使腐乳具有獨特酒香味。 酒用量過多會抑制蛋白酶活性和影響腐乳風味；酒用量過少豆腐會腐敗。 香辛料的作用：調味、防腐殺菌。（4）加鹵湯裝瓶，密封腌制：將配制好的鹵湯加入瓶中，將瓶口通過酒精燈火焰，再用膠帶密封瓶口，密封腌制6個月。 裝瓶時要迅速，瓶口要通過酒精燈的火焰，再密封。2. 腐乳品質鑒定及有關提醒：（1）評價腐乳品質：應從形狀、色、香、味、質地等方面進行評價。（2）影響腐乳品質的因素：鹽、酒、香辛料和發(fā)酵溫度。 前期發(fā)酵溫度為：1518；后期發(fā)酵溫度（腌制時）為常溫或30。 在腌制過程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可繼續(xù)發(fā)酵一段時間。（3）腐乳外表的皮是附著在豆腐上的毛霉菌絲形成的，可使腐乳成形。（4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干凈后要用沸水消毒，裝瓶、密封等環(huán)節(jié)要無菌操作。選修13：微生物的利用一、微生物的分離和培養(yǎng)【A】（一）微生物與培養(yǎng)基：1. 微生物：是指除動物界和植物界以外的所有生物，包括病毒、原核生物、真菌和原生生物等2.培養(yǎng)基：是指為人工培養(yǎng)微生物而制備的，適合微生物生長、繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質。3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽等，有的還含生長因子。 （1）碳源：如：無機碳（含碳無機物）、有機碳（糖類、脂質、蛋白質等）。無機碳：能為自養(yǎng)微生物提供碳素營養(yǎng)。無機碳是自養(yǎng)微生物的碳源。有機碳：能為異養(yǎng)微生物提供碳素營養(yǎng)和能源。（2）氮源：如：無機氮（含氮無機物）、有機氮（蛋白胨、尿素、氨基酸等）。 為微生物提供氮素營養(yǎng)。 氮氣（N2）是固氮微生物的氮源，（3）水和無機鹽：分別為微生物提供水、無機鹽營養(yǎng)。（4）生長因子：如：維生素、必需氨基酸、堿基等，滿足異養(yǎng)微生物合成酶和核酸。【提醒】含C、H、O、N的有機化合物既是碳源，又是氮源和能源。 蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麥芽汁等既含碳源又含氮源、生長因子等營養(yǎng)。4. 培養(yǎng)基的種類及其用途：（1）按物理狀態(tài)可將培養(yǎng)基分為：液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。 液體培養(yǎng)基：未加凝固劑（瓊脂）。主要用于工業(yè)生產。半固體培養(yǎng)基：加入瓊脂0.20.5%。用于觀察微生物的運動、分類和鑒定。固體培養(yǎng)基：加入瓊脂1.52%。用于微生物的分離、純化、計數和鑒定。瓊脂是最常用凝固劑，熔點：96，凝固點：40，微生物一般不能利用瓊脂。（2）按化學成分可將培養(yǎng)基分為：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基：化學成分明確。 用于微生物的分類和鑒定。天然培養(yǎng)基：化學成分不明確。用于工業(yè)生產。（3）按用途（或功能）可將培養(yǎng)基分為：基礎培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。制備方法主要用途實例基礎培養(yǎng)基含微生物生長所需要的基本物質選擇培養(yǎng)基添加或缺少某種化學物質從眾多微生物中分離出所需微生物加入青霉素分離酵母菌、霉菌等。加高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌無氮培養(yǎng)基分離固氮菌。不含有機碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)微生物鑒別培養(yǎng)基加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物伊紅美藍培養(yǎng)基可使大腸桿菌的菌落呈深紫色，可以鑒別大腸桿菌。5. 培養(yǎng)不同微生物所需要的溫度、pH和時間：細菌放線菌霉菌培養(yǎng)溫度303730372528 培養(yǎng)基pH6.57.57.58.55.06.0 培養(yǎng)天數12d57d34d（二）微生物培養(yǎng)中的無菌操作技術：1.無菌操作：是指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。 獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵：防止外來雜菌入侵（污染）。2.消毒與滅菌的區(qū)別：條件效果與目的常用方法消毒較溫和的物理或理化方法殺死物體上大部分有害微生物部分滅菌，不包括殺滅芽孢和孢子。煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學藥劑消毒法等滅菌強烈的理化因素殺死物體內外所有微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。3.常用消毒方法：（1）煮沸消毒法：100煮沸56min。常用于罐裝食品、日常食品的消毒。（2）巴氏消毒法：7075下煮30min或80下煮15min。用于牛奶、果汁消毒。（3）化學藥劑消毒法：7075%酒精、碘酒、新潔爾滅等可用于皮膚、傷口等處消毒。 氯氣用于水源消毒。（4）紫外線消毒：30W紫外線燈照射30min。用于對接種室的空氣進行消毒。4.常用滅菌方法及其應用： 主要方法（及器械）適用范圍灼燒滅菌用酒精燈火焰（外焰）灼燒接種環(huán)、接種針、試管口、三角瓶口。干熱滅菌置于干熱滅菌箱中，160170加熱12h。培養(yǎng)皿、試管等玻璃器皿，不適合其他方法滅菌的金屬用具等高壓蒸氣滅菌（濕熱滅菌）置于高壓滅菌鍋中100 kPa、121、1530 min培養(yǎng)基、無菌水及多種器材、物品。5.無菌技術具體做法： （1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清洗和消毒。（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近（旁）進行。（4）實驗操作時應避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。6.（高壓滅菌鍋）高壓蒸汽滅菌的操作方法： （1）加水：裝水量要沒入電熱管，以防干燒爆裂，加水后放入滅菌桶。（2）裝鍋：將所要滅菌的材料裝入鍋內。（不要裝得太滿），（3）密封：蓋上鍋蓋，兩兩對稱地擰緊螺栓。（4）加熱排氣：打開排氣閥，接通電源加熱；約2分鐘后有氣體排出，排氣約5分鐘后關閉排氣閥?！咀⒁狻恳欢ㄒ獙⒗淇諝馀疟M，否則達不到滅菌效果。（5）保溫保壓：當壓力上升至100kPa（0.1MPa）或溫度達121時,維持2030分鐘；然后關掉電源。 （6）出鍋：待壓力表指針回到零，溫度下降至60以下，打開排氣閥，開蓋取出鍋內物品。一定要等到壓力表指針回到零時，才能排氣開蓋。否則壓力過大會導致培養(yǎng)基等內容物沖出，造成污染。 滅菌完成后要將鍋內余水倒出，保持內壁內膽干燥。（三）培養(yǎng)基的配制、滅菌和倒平板。1. 培養(yǎng)基的配制原則：目標要明確。營養(yǎng)要協(xié)調。pH要適宜。2. 細菌培養(yǎng)基的配制：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制過程：1000mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方成分牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂含量5.0g10.0g5.0g20.0g將上述物質溶解后，添加蒸餾水定容至1000mL（1）計算和稱量：根據表中配方計算培養(yǎng)基各成分用量，并逐一稱取。【注意】牛肉膏和蛋白胨容易吸潮，稱取時動作要迅速。牛肉膏粘稠度較大稱取時要細心。（2）溶化：將稱取的各成分與水混合后進行加熱溶化。 應將稱量好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯；待溶化干凈后取出。在加熱溶化過程中要用玻璃棒不斷攪拌，以防止糊底而導致燒杯破裂。（3）調節(jié)pH：用pH試紙測pH，通過滴加3%HCI或NaOH將pH調到7.07.5。（4）分裝：將培養(yǎng)基分裝到試管或三角燒瓶中，分裝好后用棉塞塞緊管口或瓶口。培養(yǎng)基分裝量：試管：為其高度的1/5。三角燒瓶：不超過瓶容積的1/2。分裝時培養(yǎng)基不能污染試管口或瓶口。對試管或三角燒瓶要標記和編號。（5）包扎：試管：35支扎成一捆，外包一層牛皮紙（防污染），用線扎好。三角燒瓶：用牛皮紙包扎好，以防水蒸汽污染。（6）滅菌：將包扎好的試管或三角燒瓶放入高壓滅菌鍋內進行高壓蒸汽滅菌。培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，160170下滅菌12h后備用。（7）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50左右（剛剛不燙手）在酒精燈火焰附近倒平板。將滅菌過的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰2-3次，以防瓶口附近微生物污染培養(yǎng)基。用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基約1020mL倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。等待平板冷卻凝固，約需要510 min；然后將平板倒過來放置。 平板冷凝后要倒置的原因：防止皿蓋上冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。倒平板操作應在酒精燈火焰附近進行，以防雜菌污染。倒平板時，培養(yǎng)基不能濺在皿蓋與皿底之間的部位，也不能濺在皿蓋與皿壁上。若是裝入試管的培養(yǎng)基，滅菌后要擱置斜面，斜面長度不超試管長度的1/2。（8）無菌檢查：檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底，方法是：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的恒溫箱中培養(yǎng)2448h，觀察有無菌落形成。（四）微生物接種技術： 1.接種器具：包括：接種環(huán)（劃線接種）、接種針（穿刺接種）、玻璃刮鏟（涂布用）。2.接種方法：包括：平板劃線法、涂布平板法、穿刺接種法、斜面接種法等。 微生物分離純化的最常用接種方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。3. 平板劃線法：特點：操作簡單，但單菌落不易分離。（1）原理：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步 稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數次劃線后, 可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.（2）操作方法：將接種環(huán)放在火焰上灼燒，至接種環(huán)燒紅；在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。將試管口通過火焰數次，將已經冷卻的接種環(huán)伸入菌液，沾取一環(huán)菌液。將試管口通過火焰數次，并塞上棉塞。左手將培養(yǎng)皿蓋打開一條縫隙，右手將接種環(huán)迅速伸入平板內，劃35條平行線，蓋上培養(yǎng)皿蓋?！咀⒁狻坎灰獎澠婆囵B(yǎng)基。燒灼接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后；從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內劃線。最后區(qū)域不能與第一區(qū)域相連。將平板倒置，放入恒溫箱中培養(yǎng)。 （3）【提醒注意】 接種全過程都需要在酒精燈火焰旁進行，每次劃線前后都要灼燒接種環(huán)。 第一次劃線前灼燒接種環(huán)的目的：燒掉接種環(huán)上被污染的雜菌。 第二次及其之后劃線前后灼燒接種環(huán)的目的：燒掉接種環(huán)上殘留的菌種。 每次劃線接種時都需要將灼燒的接種環(huán)冷卻后才能劃線，以防燙死菌種。 接種劃線時不能劃破培養(yǎng)基，最后區(qū)域所劃線不能與第一區(qū)域的相連4. 稀釋涂布平板法：特點：操作復雜，但單菌落容易分離。（1）原理：將菌液進行一系列的梯度稀釋（常為10倍梯度），然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂平板表面，經過培養(yǎng)，在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，在培養(yǎng)皿表面形成單個菌落。（2）操作方法： 取合適稀釋度的少量菌液（0.5mL）在酒精燈火焰附近滴加到平板表面。 從酒精溶液中取出涂布器，把涂布器上粘附的酒精在酒精火焰上燃盡滅菌。 在酒精燈火焰附近，用冷卻后的涂布器（即玻璃刮鏟）把菌液涂布均勻。 把用涂布接種的培養(yǎng)皿放在恒溫箱中（37恒溫）培養(yǎng)12天取出。稀釋涂布平板法統(tǒng)計的菌落數目比活菌的實際數目少。原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是1個菌落。（五）菌種保藏方法：1. 臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2. 長期保存：甘油冷凍管藏法（即：甘油管藏法。20保存）。二、微生物的分離和培養(yǎng)（實踐）【B】（一）分離純化大腸桿菌：1. 配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：包括：計算稱量溶化（含調pH）滅菌倒平板。2. 分離純化大腸桿菌的接種方法：劃線平板法和稀釋涂布平板法。3. 接種后的培養(yǎng)基的培養(yǎng)：置于恒溫箱中37培養(yǎng)12d。4. 挑取大腸桿菌菌落多次進行接種培養(yǎng)可以純化大腸桿菌菌種。5. 菌種保存方法：臨時保藏（4保存）和長期保存（甘油管藏：20保存）.（二）土壤中分解尿素的微生物的分離與計數：1.篩選原理及方法：（1）原理：尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素為氮源。（2）篩選方法：用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物進行篩選。2. 實驗方法步驟：本實驗采用稀釋涂布平板法和活菌計數法。（1）土壤取樣：從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中?！咀⒁狻咳⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的信封在使用前都要滅菌。（2）制備培養(yǎng)基：按下列配方制備以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基。KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素瓊脂pH調至7.07.2，加蒸餾水定容至1000ml1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g需要設置無尿素培養(yǎng)基作空白對照，即：表中尿素用等量的無菌水替換。（3）土壤樣品稀釋：制備不同稀釋度的土壤懸液。方法如下： 稱取0.5g土壤，倒入盛有50mL無菌水的錐形瓶，振蕩20min，充分打散土壤，制成102g/mL的土壤懸液。用無菌移液管吸取0.5mL（102g/mL）的土壤懸液注入盛有4.5mL無菌水的1號試管，配制成103g/mL的土壤懸液。取另一支無菌移液管吹吸1號管3次，使懸液均勻，再吸取0.5mL注入盛有4.5mL無菌水的2號試管，配制成104g/mL的土壤懸液.。依此類推，配制105、106、107、108g/mL的等濃度的土壤懸液。 每次吸取土壤懸液前都要用移液管吹吸懸液3次的目的：使土壤懸液均勻。 分離不同的微生物采用不同稀釋度（因不同微生物在土壤中含量不同）。見下表：細菌放線菌霉菌稀釋度104、105、106103、104、105102、103、104目的保證獲得菌落數在30300之間、適于計數的平板【提醒】人教版是配制10mL不同濃度的土壤懸液，其方法與上述方法相同。（4）接種：采用（稀釋）涂布平板法。具體操作如下： 從最低濃度（108g/mL）土壤溶液開始，分別用無菌移液管吸取1mL（人教版為0.1mL）加入到相應編號的培養(yǎng)基中，每個濃度設置至少3個重復（三個平板），再用涂布器（玻璃刮鏟）涂布均勻。 每次吸取土壤懸液前都要將土壤懸液充分振蕩，混合均勻；每一步都應做到無菌操作。操作時，移液管和試管口應在離火焰12cm處。實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。（5）培養(yǎng)與觀察：將已標明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期和樣品稀釋度的培養(yǎng)皿，倒置放在37的恒溫箱培養(yǎng)12d，觀察細菌菌落。（6）計數菌落：每隔24h統(tǒng)計菌落一次，選取菌落數目穩(wěn)定時的數據作結果，以防止培養(yǎng)時間不足而遺漏某些菌落。計算時應選擇菌落數為30300的平板上進行計數，要計算平均數。每克樣品菌落數（用液1mL）某一稀釋度重復培養(yǎng)菌落平均數稀釋倍數。統(tǒng)計的菌落數比活菌的實際數目少。原因是：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是1個菌落。4. 結果分析與評價： 同一土樣的重復組統(tǒng)計的結果應相近。（1）若未接種的培養(yǎng)基中沒有菌落，說明培養(yǎng)基未被雜菌污染，反之，則被污染。（2）若空白對照組培養(yǎng)基上有菌落生長，原因可能是被固氮微生物污染或培養(yǎng)基中混入了其他氮源。（3）若實驗中得到2個或2個以上菌落數在30300的平板，表明稀釋操作成功，可以進行計數統(tǒng)計。（4）若同一稀釋度的3個重復的菌落數相差懸殊，表明試驗不精確，需要重新實驗?！局R拓展】1土壤中微生物數目的統(tǒng)計方法：包括：直接計數法和間接計數法（活菌計數法）。（1）直接計數法：用血球計數板制片后在顯微鏡下觀察計數。 取樣計數方法與培養(yǎng)液中酵母菌計數方法類似。 土壤微生物的稀釋要求：以達到每小格內有510個菌體為宜。經稀釋的土壤樣品應重復計數3次，取其平均值。 1mL土壤懸液中菌體總數 = 4106每小格中的菌體數土壤懸液稀釋倍數。（2）間接計數法（活菌計數法）采用稀釋涂布平板法，統(tǒng)計菌落數進行計數。要設置對照和重復，每個稀釋度土壤懸液至少設置3個重復。選擇菌落數為30300的平板上進行計數，并計算平均數。每克土壤樣品中菌落數菌落數 稀釋倍數 涂布體積。2. 鑒定能分解尿素的微生物的方法：脲酶檢測法。（1）原理：尿素經脲酶分解