獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)

獸醫(yī)微生物實(shí)臉

實(shí)驗(yàn)一坡璃器皿的準(zhǔn)備及常用儀器的使用

［目的］

系統(tǒng)掌握坡璃器皿的準(zhǔn)備方法及常用儀器的使用。

一、坡璃器皿的無(wú)害處理：

1、新購(gòu)置的坡璃器皿因含有游離堿，一般在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時(shí)后再用

清水洗凈,也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗凈。

2、常用玻璃器皿洗滌時(shí)可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗，然后用自來(lái)水沖洗干凈。

3、帶油污坡璃器皿先將倒空的玻璃器皿用10%的氫氧化鈉浸泡半小時(shí)或放在5%

的蘇打液內(nèi)煮兩次，去掉油污，再用洗衣粉和熱水刷洗。

4、帶菌玻璃器皿經(jīng)121T高壓蒸汽滅菌20min后，趁熱倒去內(nèi)容物，再用洗衣粉

水刷洗干凈，以水在內(nèi)壁均勻分布成一薄層而不出現(xiàn)水珠為油垢除盡的標(biāo)準(zhǔn)。

經(jīng)以上處理的玻璃器皿，可滿足一般實(shí)驗(yàn)用。少數(shù)實(shí)驗(yàn)對(duì)玻璃器皿清潔度要求較高，除用上述

方法夕卜，還應(yīng)先用2%的HQ溶液浸泡數(shù)lOmin,再用自來(lái)水沖洗,蒸饋水淋洗2?3次。有

的尚需超純水淋洗然后烘干備用。

二、玻璃器皿的包扎：吸管、平皿、瓶口等的包扎

三、玻璃器皿的滅菌：分為兩種，高壓蒸汽滅菌法和干熱滅菌法。

高壓蒸汽滅菌法是濕熱滅菌中應(yīng)用最為廣泛的一種方法。其原理是依據(jù)在一個(gè)密閉的高壓蒸汽

滅菌器中，水的沸點(diǎn)隨水蒸汽壓的?加而上升，加壓是為了提高水蒸汽的溫度。把待滅菌物品放

在滅菌器內(nèi)，當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力為O.IMPa時(shí)，溫度可達(dá)到，一般維持20minf即可殺死

一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體及其泡子。一般的培養(yǎng)基、玻璃器皿、金屬用具、實(shí)驗(yàn)服、傳

染性標(biāo)本等均可用這種方法有效滅菌。滅菌的溫度及時(shí)間視滅菌物品中的微生物種類及數(shù)量而

定。

干熱滅菌法也叫熱空氣滅菌法。實(shí)驗(yàn)室通常使用恒溫控制的電熱鼓風(fēng)干燥箱作為干熱滅菌

器。此法常用于空的坡璃器皿、金屬器具和其他耐高溫的物品（如陶裔培養(yǎng)皿蓋、石蠟油、

碳酸鈣）的滅菌。其優(yōu)點(diǎn)是滅菌器皿保持干燥。但帶有膠皮、塑料的物品、液體及固體培養(yǎng)基

不能用此法。干熱滅菌一般以能否殺死細(xì)菌的芽抱作為徹底滅菌的標(biāo)準(zhǔn)，160-170（,

2-3h方可殺死細(xì)菌的芽抱。

［實(shí)期才料］

吸管若干、平皿5付、鹽水瓶1介、中試管、小試管、脫脂棉、紗布等

［實(shí)驗(yàn)內(nèi)容］

一、各種坡璃器皿的包扎

二、棉塞的制作視管口大小取脫脂棉若干，順纖維方向?qū)盈B，用力卷緊后用紗布包

扎，以套入視管口1/2為宜。

三、各種常用儀器的使用方法及注意事項(xiàng)

I高壓蒸汽滅菌器

操作方法：

加水：打開滅菌鍋蓋，加水適量（手提式高壓鍋加水到與支架圈平行處）

翻：將帶滅菌物品放于滅菌桶內(nèi)，物品冒做注意彼此間留有一定空隙，使蒸汽在容器內(nèi)能夠流

通達(dá)到每個(gè)物品的部位，以免形成蒸汽死角。物品不要緊靠桶壁，防止冷凝水進(jìn)入滅菌物品。

密封：將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，使罐內(nèi)冷空氣自下而上^出，加蓋，上下雌口對(duì)齊，

采用對(duì)角方式均勻旋轉(zhuǎn)擰緊螺栓，使滅菌鍋密閉。

加熱：打開排氣口（放氣閥），排氣5-10min后（或噴出氣體不形成水霧），此時(shí)蒸汽已

將鍋內(nèi)的冷空用逅，關(guān)閉放氣閥。溫蒸汽壓力熠高而上升。待壓力逐漸上升至所需溫度時(shí),

期啜褫，縮$所需壓力和降，麗始時(shí)，到達(dá)規(guī)定時(shí)向，關(guān)閉熱源，停止1HB,壓力隨之逐

漸降低。

降壓、取料：待壓力自然降至"0"后，打開放氣閥，松動(dòng)螺栓，開蓋。立即取出滅菌物品,

以免油鍋蓋和器壁上的水滴弄濕包裝紙或被滅菌物品，增加染均的概率。斜面培養(yǎng)基官鍋

內(nèi)取出后要趁熱擺放，滅菌后的空培養(yǎng)皿、試管等要烘干或晾干。

清理：滅菌完畢后，除去鍋內(nèi)剩余水，保持鍋內(nèi)干燥。若連續(xù)使用則需每次補(bǔ)足水分。注

意事項(xiàng)：

高壓蒸汽滅菌的技術(shù)關(guān)鍵是在壓力上升之前先排除鍋內(nèi)的冷空氣。若鍋內(nèi)仍有滯留的;轉(zhuǎn)

氣，壓力表雖達(dá)到指定壓力但鍋內(nèi)溫度卻達(dá)不到相應(yīng)的溫度，滅菌效果不好。

滅菌時(shí)人不能離用R!場(chǎng),要嚴(yán)格控制熱源維持滅菌時(shí)的壓力。壓力過(guò)高不僅培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分被

破壞，而且高壓鍋超過(guò)耐壓范圍易發(fā)生爆炸造成傷人事故《滅菌完畢后要自然冷卻，切忌用涼水

澆滅端辣降溫壓力降至"0"位前不能開蓋，以免培養(yǎng)基沸騰噴出或沾濕棉塞。2、干熱滅

菌器（電熱鼓風(fēng)干燥箱、干烤箱）

操作方法：

裝料：滅菌前先將玻璃器皿、金屬用具用包扎紙（不用油紙）包好，培養(yǎng)皿也可裝入金屬盒

內(nèi)，然后均勻放入干榔§內(nèi)。物品不雌放過(guò)擠，不能緊靠箱壁，使空氣流通，溫度均勻。升溫：

接通電源，打開開關(guān)，雌闿詢的調(diào)氣閥，打開通氣孔，H滁箱內(nèi)叫氣和水汽,升溫，待箱內(nèi)

溫度達(dá)到8（TC時(shí)，關(guān)閉通氣孔，打開鼓風(fēng)機(jī)，使箱內(nèi)溫度均勻。

維持恒溫：繼續(xù)加熱，待溫度達(dá)到。（:時(shí)，保溫維持

160J702ho

降溫：滅菌完畢，切斷電源，當(dāng)箱內(nèi)溫度冷卻至60℃時(shí)方可開箱取出物品。

注意事項(xiàng)：滅菌過(guò)程中溫度不能上升或下降過(guò)急。溫度達(dá)到6(rc以上時(shí)，不能隨意打開干燥

箱門。

3、冰箱常用于菌種保藏。有?4。《?20。&-70(。

4、離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)二顯微鏡油鏡的使用及細(xì)菌基本形態(tài)觀察

［目的］

1.了解光學(xué)顯微鏡的簡(jiǎn)單構(gòu)造原理、使用方法和保護(hù)要點(diǎn)。熟練掌握油鏡

的使用方法。

2.認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)和構(gòu)造。通過(guò)細(xì)菌標(biāo)本片觀察，進(jìn)一步熟悉使用光學(xué)顯微鏡。

［原理］

1.微生物個(gè)體微小。肉眼難以看見，必須借助顯微鏡才能觀察到其個(gè)體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此,

顯微鏡是微生物學(xué)研究必不可少的工具，正是顯微鏡的發(fā)明使人類揭開了微生物世界的奧秘。

耐科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及微生物研究的需要,顯微鏡從使用可見光源的普通光學(xué)顯微鏡發(fā)展到使用

紫外線光源的熒光顯微鏡，進(jìn)一步發(fā)展到用電子流代替照明光源的電子顯微鏡，使放大率和分辨

率大大提高，為微生物學(xué)的發(fā)展提供了保障。此外，根據(jù)不同的用途還有暗視野、相差顯微鏡等。

普通光學(xué)顯微鏡由棚鰥統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩部分組成怖!系統(tǒng)包括有：鏡座、載物臺(tái)、鏡臂、鏡筒、

物朦骸器、調(diào)節(jié)器；光學(xué)部分包括有目漲物麻聚光器、反光鏡。有些較好的顯微鏡自身帶有

照明裝置。在檢查細(xì)菌標(biāo)本，多用油鏡進(jìn)行。油鏡是一種放大倍數(shù)較高(95~100倍)的物鏡，

一般都刻有放大倍數(shù)(如95X、100X等)和特別的標(biāo)記，以便于認(rèn)識(shí)。國(guó)產(chǎn)鏡多用油字表示，

國(guó)外產(chǎn)品則常用“Oil"(OilImmersion)或

“HI"(HomogeneousImmersion)作記號(hào)。；隔上也常漆有黑環(huán)或紅環(huán)，而且鏡的鏡身

較高倍鏡和低鏡為長(zhǎng)，鏡片最小，這也是識(shí)別的另一個(gè)標(biāo)益

2.油鏡的原理：油鏡頭的晶片細(xì)小，進(jìn)入鏡中的光量亦較少，其視野較高倍鏡暗。當(dāng)油鏡

頭與覦片之間為空氣所隔時(shí)，因?yàn)榭諝獾恼酃庵笖?shù)與坡璃不同，故有TP分光線被折射而不

能進(jìn)入鏡頭之內(nèi)，幽雌？更暗;熱t(yī)與弱5片之間M上與蝌蜥瓶能相近的油^，如柏木

；靖，貝斶不會(huì)因折射而損失太大，可使視野充分牌月，能滑

用方法：進(jìn)行5由鏡檢查時(shí)，應(yīng)㈱好光線，但不可直對(duì)陽(yáng)光,采取晶繇度附磁光器，開大痢,

喻就輜。然割林■功啪（物詡，，酶楸綺領(lǐng)IE中。輟懶

na=i幾乎耳物耐般度（畫礴瞰的鼬目鐲甥膜|機(jī)同時(shí)圜辮敏詡

螺旋，提iftM護(hù)噤fflffl城齷H悔匍，茹卿朦瞰懶5,薜勵(lì)微雕，MS嫡

清晰為止另一種是固定鏡筒調(diào)節(jié)載物臺(tái)的顯微鏡，調(diào)焦時(shí)，鏡片先與油鏡頭接觸，再慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)

粗螺旋，將臺(tái)往下調(diào)，能酶看到物像時(shí)，再轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋，直至物像清晰為止，隨即迸行

檢查觀察。油鏡用過(guò)后，應(yīng)立即用擦，日微頭擦拭干凈，如油漬已干，則須用擦制曜少許二

甲苯溶解并拭去油漬，然后再用干擦鏡紙拭凈鏡頭。

4.細(xì)菌是單細(xì)胞生物，盡管個(gè)體微小，但有其完整的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的基本形態(tài)可分

為球狀、桿狀和螺旋狀三種。除細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)等基本結(jié)構(gòu)外，尚有鞭毛、菌

毛、芽抱、英膜、質(zhì)粒等附屬結(jié)構(gòu)。

［實(shí)驗(yàn)材料］

1.標(biāo)本：

大腸桿菌、葡萄球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌（培養(yǎng)物片及組織片）、變形桿菌、魏氏梭菌、

巴氏桿菌、醵母菌的染色標(biāo)本。

2.儀器及其他物品

普通光學(xué)顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等

［實(shí)驗(yàn)內(nèi)容］

1.用低、高倍鏡觀察酵母菌

(1).將低倍物鏡(10x)轉(zhuǎn)到工作位置。上升聚光器，將光圈打開，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，

使視野明亮。

(2).將標(biāo)本片放于載物臺(tái)上并上升載物臺(tái)到最高。

(3).轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)螺旋，當(dāng)目鏡中看到模糊物像時(shí)再轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋直至物像清晰為止。觀察醵母

菌的形態(tài)特點(diǎn)。

(4).高倍鏡觀察：用手按住物鏡轉(zhuǎn)換器慢慢旋轉(zhuǎn)將物鏡轉(zhuǎn)換成高倍鏡(40x),轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)將

物像調(diào)至清晰，進(jìn)行觀察。

2.用油鏡觀察細(xì)菌標(biāo)本片

(1).用10x鏡對(duì)光，使視野明亮

(2).在標(biāo)本片觀察部位滴加少量香柏油后放于載物臺(tái)上，轉(zhuǎn)換物鏡為油鏡。緩慢上升載

物臺(tái)使油鏡浸入香柏油中，并從側(cè)面觀察，使鏡頭上升至睨晡接近玻片又不與玻片相撞的合適

位置，避免壓碎鏡頭晶片。

(3).緩慢下降載物臺(tái)，同時(shí)從目鏡中觀察，直至出現(xiàn)模糊的物像時(shí)再用細(xì)螺旋調(diào)至物像

清晰為止。觀察細(xì)菌基本形態(tài)及特殊構(gòu)造。

3.顯微鏡用后的處理

(1).處理玻片加2-3滴二甲苯于標(biāo)本片上，使香柏油溶解，再用擦鏡紙擦凈保存供以

后使用。

(2).清潔顯微鏡先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用蘸有二甲苯的擦鏡紙擦掉殘留的

香柏油，最后用干凈的擦鏡紙抹去殘留的二甲苯；清潔目讖和其他物鏡，可直接用干凈的擦

鏡紙擦凈；用柔軟的綢布擦凈機(jī)械部分的塵土。最后將物鏡轉(zhuǎn)成"八”字式，下降載物臺(tái)，

聚光器降至最低位置，反光鏡鏡面轉(zhuǎn)成垂直狀。

實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌涂片的制備及革蘭氏染色

［目的］

L掌握細(xì)菌涂片的制備方法及革蘭氏染色。

2.學(xué)習(xí)無(wú)菌操作，樹立無(wú)菌觀念。

［原理］

細(xì)小，月，期1,，色（由于毛

細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用以及離子交換、酸堿親和等化學(xué)作用，染樣能使細(xì)菌著色，

并且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同而有不同的染色反應(yīng)）后，使其與背景形成明顯的色差,

從而郵清楚曲畸IJ細(xì)菌的基本形態(tài)K結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同趣色反應(yīng)，可作為慨!I細(xì)菌的一種依

據(jù)。微生牧染f4是一種帶新的有機(jī)化合物，其分子上具有發(fā)色基助包L給化合物以

特有的顏色，但不能與細(xì)菌結(jié)合;后者使化合物具成鹽的性質(zhì)，能ffl菌怖合。分為嘲斗、酸

輛中除科三類。根蒯菌個(gè)體形初期不同要求，可修色分為三種方法即簡(jiǎn)單染色

鑒SU染色和祿踩包

革蘭氏染色：1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立。此法可將所有細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性

菌（G+）和革蘭氏陽(yáng)性菌（G.）兩大類。是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法，有著重要的理

論和實(shí)踐意義。其染色過(guò)程是先用草酸錢結(jié)晶紫進(jìn)行初染，再加媒染劑-革蘭氏碘液，以增加

染料和細(xì)胞的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成相對(duì)分子量較大的復(fù)合物，然后用脫色劑?

乙醇B兌色，最后用沙黃液復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色（紫色）者即為G+菌反之，

脫色后染上發(fā)染劑顏色（紅色）者即為G.苗.其原理是利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組的￡分和結(jié)構(gòu)的不同，通遍咆加以鑒別。

革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的

肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，且類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇處理發(fā)生1腓作用后反而使其孔徑縮小，通透

性降低，結(jié)晶紫-碘形成的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性

菌的的肽聚糖層靖，網(wǎng)向交聯(lián)少，而且類脂質(zhì)含量較高，經(jīng)乙醇處理后，細(xì)胞壁孔徑變大，

通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，結(jié)果細(xì)菌被脫色，再經(jīng)沙黃復(fù)染后呈現(xiàn)紅色。

［實(shí)驗(yàn)材料］

(1)菌種：大腸桿菌、葡萄球菌的斜面培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)物各一管。

(2)材料：載玻片、接種棒、酒精燈、打火機(jī)、吸水紙(濾紙本八無(wú)菌水、染色缸、香柏

油、二甲苯等。

(3)染色液：草酸按結(jié)晶紫染液、革蘭氏碘液、95%乙醇、沙黃染色液。

(4)儀器：顯微鏡

［實(shí)瞼內(nèi)容】

1.細(xì)菌涂片的制備

(1)坡片準(zhǔn)備載玻片應(yīng)清晰透明，潔凈而無(wú)油潰，滴上水后，能均勻展開，附著性好。如

有殘余油漬，可按下列方法處理：滴95%酒精2~3滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈

外焰上輕輕拖過(guò)幾次。也可提前將玻片浸泡在95%的乙醇中預(yù)先脫脂備用。

(2)涂片針對(duì)所用材料不同，涂片方法也有差異。

a.液體材料(如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等)可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于坡片

的中央均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。

b.非液體材料(如菌落、膿,糞便等)則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸饋水，置于坡片

中央，然后再用滅菌接種壞取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。

C.組織臟器材料可先用銀子夾持中部，然后以滅菌或潔凈翦刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面

在坡片上壓印(觸片)或涂抹成一薄層。

如有多個(gè)樣品同時(shí)需要制成抹片,只要染色方法相同，可在同一張玻片上有秩序地同府，做多

點(diǎn)涂抹，或先在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品并做好記錄。

(3)干燥上述涂片應(yīng)讓其室溫自然干燥。

(4)固定有兩類固定方法。

火焰固定(物理固定)：將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈外烙上如鐘擺

樣來(lái)回拖過(guò)數(shù)次，略作加熱(但不能太熱，以不燙手為度)進(jìn)行固定。

化學(xué)固定：血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩((Giemsa)染色，不用火焰固定，而用甲醇固

定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3min,取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作

用2~3min,自然揮發(fā)干燥，抹片如做瑞氏(wrights)染色，則不必先做特別固定，染料中

含有甲醇，可以達(dá)到固定的目的。

抹片固定的目的有如下幾點(diǎn)：

(1)除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附在坡片上，以免水洗時(shí)易被沖掉。

(2)使抹片易于著色或更好地著色，因?yàn)樽冃缘牡鞍踪|(zhì)比變性的蛋白質(zhì)著色力更強(qiáng)。

(3)可殺死抹片中的微生物。

必須注意,南片固定過(guò)程中，實(shí)際上并不能保證殺死全§削菌,也不能完全避免蹂色水洗時(shí)

不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽抱的病原菌的抹片時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格慎重

處理染色用過(guò)的殘液和抹片本身，以免引起病原的黝S。

2.革蘭氏染色

(1)初染：將玻片置于染色架上，加草酸鍍結(jié)晶紫溶液(量以覆蓋滿涂抹面為宜)，染

l-2min,倒去染液水洗,

⑵媒染：加革蘭氏碘液，染l-2min,水洗。

(3)脫色：加95%乙醇，將玻片輕搖幾下即傾去乙醇，如此重復(fù)幾次，直至乙醇液不呈現(xiàn)紫色

時(shí)停止，約20-60秒，立即水洗。

(4)復(fù)染：滴加沙黃染液，染l-2min,水洗。

3.鏡檢

將染色好的坡片夾入濾紙本中，吸去水分。滴加香柏油后油鏡觀察。4.

實(shí)驗(yàn)完畢后處理

(1)清潔顯微鏡

(2)坡片處理高壓滅菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干備用。

實(shí)晚四培養(yǎng)基的制備

［目的］

1.掌握一般培養(yǎng)基制備的原則和要求。

2.熟悉一般培養(yǎng)基制備的過(guò)程。

3.掌握培養(yǎng)基酸堿度的測(cè)定。

［原理］

培養(yǎng)基是用人工方法將多種物質(zhì)按照各類微生物生長(zhǎng)的需要而合成的一種混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，一股

'?111.----踴類及代般輜片樣性，故用開蹄性物的種類也很多。

它們的配方及配制方法雖各耨異，但培養(yǎng)基的配制步驟卻大致相同。即先按a昉稱取藥品，用

少量水先溶解各成分，待完全溶解后補(bǔ)足水至所需量，調(diào)整pH,然后將培養(yǎng)基分裝于合適的容

器中，經(jīng)滅菌后使用或備用。同時(shí)應(yīng)做無(wú)菌檢查。

制作培養(yǎng)基的要求：

(1)培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

(2)培養(yǎng)基的材料和盛培養(yǎng)基的容器應(yīng)沒(méi)有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。

(3)培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長(zhǎng)的要求。多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)適宜pH范圍是弱堿性(pH7.2~

7.6)。

(4)所制培養(yǎng)基應(yīng)均質(zhì)透明，以便觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)性狀和其他代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。

(5)必須徹底滅菌，不得含有任何活細(xì)菌。

［實(shí)瞼材料］

1.器皿：量筒(100mL)、燒杯QOOOmL和100mL各一介)、漏斗、三角燒瓶(100mL)、

試管、坡棒、刻度吸管(1mL和10mL各一個(gè))、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、

試管塞、包裝紙、扎繩、洗耳球等。

2.試劑：牛肉青、蛋白陳、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條或粉、0.1mol/L和lmol/L的氫

氧化鈉、0.1mol/L和lmol/L的鹽酸溶液、蒸饋水、無(wú)菌的脫纖綿羊或家兔鮮血。

［實(shí)驗(yàn)內(nèi)容］

每組需制備普通肉湯培養(yǎng)基(牛肉音蛋白陳培養(yǎng)基)200mL。其中50mL用于制作普通營(yíng)

養(yǎng)肉湯；50mL用于制備普通斜面；剩余部分用于制作普通瓊脂平板。

1.普通肉湯培養(yǎng)基的制作

牛肉盲0.5%蛋白陳1%氯化鈉0.5%磷酸氫二鉀0.1%蒸播水

按以上劑量稱取各種試劑(先稱取鹽類再稱蛋白陳及牛肉膏)，置于燒杯內(nèi)加熱溶解備用。

2.pH的矯正

(1)試紙法因初配好的牛肉音蛋白陳培養(yǎng)液是偏酸性的，故要用NaOH調(diào)整。為避免

過(guò)堿，應(yīng)緩慢加入NaOH,邊加邊攪拌，并不時(shí)地用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH。也

可取培養(yǎng)基5mL于干凈試管中，逐滴加入NaOH調(diào)pH至7.4~7.6,并記錄NaOH的用

量，再換算出培養(yǎng)基總體積中須加入NaOH的數(shù)量，即可調(diào)至所需的pH范圍。

（2）標(biāo)準(zhǔn)比色法

待已配好的培養(yǎng)基冷至5（rc左右時(shí)，調(diào)該溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法為：①

取兩支與標(biāo)準(zhǔn)比色管（pH7.4-pH7.8）相同的空比色管，加入欲測(cè)的肉湯培養(yǎng)基5ml,其

中一管內(nèi)加0.02%酚紅指示劑0.25ml（滴定管），搖勻。②按圖2所示排列，舉起比色

架，若

滴定管色調(diào)較淡

或?yàn)辄S色，即表示

培養(yǎng)基偏雌，需

滴加0.1mol/L

NaOH矯正；若

偏堿性，應(yīng)滴加0.1mol/LHCI矯正；使之與標(biāo)準(zhǔn)比色管色澤相同為止。維帶懿

肉湯均呈酸性。記下用去的NaOH（或HCI）溶液量，由此計(jì)算出矯正全量培養(yǎng)基時(shí)所需

lmol/LNaOH（或HQ）溶液量。

圖2pH比色架

計(jì)算公式：所需0.1mol/L氫氧化鈉量二（培養(yǎng)基量x校正時(shí)用去0.1mol/LNaOHg）/5xl0

3.營(yíng)養(yǎng)肉湯的制備：

量取已矯正pH的肉湯培養(yǎng)基50mL于鹽水瓶中，塞上棉塞，用包裝紙?jiān)媒?jīng)12FC滅菌

15min后過(guò)濾分裝中試管，每管約5mL,滅菌備用。

4.普通斜面的制備

量取已矯正pH的肉湯培養(yǎng)基50mL于燒杯中，稱取1克瓊脂粉加入，加熱煮沸,待瓊脂

完全融化后，分裝試管（動(dòng)作要快，防止瓊脂凝固），每管約4~5mL（約3指高），試管分裝

完畢塞好棉塞，121c滅菌15-20min后，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定坡

度，凝固后即成普通瓊脂斜面。

5.普通瓊脂平板的制備

量取剩余的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按L5?2%加入瓊脂粉，121C滅菌15?20min。將瓊脂瓶緊

握手中覺得燙手，但仍能握持時(shí)，即為傾倒平皿的合適溫度（50~60℃）。每只滅菌培養(yǎng)皿

倒入10~15mL（以鋪滿皿底為宜），蓋上皿蓋，凝固后即成普通瓊脂平板。翻轉(zhuǎn)放入冰

箱備用。

6.鮮血瓊脂培養(yǎng)基制備

有些細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需在培養(yǎng)基中加入營(yíng)養(yǎng)因子如血液、血清等。

將已融化的滅菌普通瓊脂培養(yǎng)基冷至50C左右，無(wú)菌操作加入無(wú)菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%

（即每100mL普通瓊脂加入鮮血5~6mL）混合后，分裝滅菌試管立即擺成斜面或傾注于滅

菌平皿（如果瓊脂溫度過(guò)高，鮮血加入后則成紫褐色，溫度過(guò)低，則鮮血加入瓊脂易凝不易混

合。注意，混合時(shí)切勿產(chǎn)生氣泡）。待凝固后，置37C培養(yǎng)24h,無(wú)菌檢驗(yàn)合格方可應(yīng)用。

半成品培養(yǎng)基包見成的商品出售。只要按瓶簽上的說(shuō)明及所需量和要求直接溶解、分裝、滅菌

制成平斗面即可。半成品培養(yǎng)基，瞰培^基所含成分的特性不同，有的可高壓滅菌，有的則

不宜高壓滅菌，如SS瓊脂、沙門氏菌、志賀菌硼培^基不可高壓滅菌或過(guò)久加熱，麥康凱瓊

脂、三糖鐵瓊脂均可進(jìn)行高壓滅菌。

實(shí)驗(yàn)五自然界中微生物的分布

［目的］

1.了解周圍環(huán)境中微生物的存在和分布狀況。

2.了解無(wú)菌操作在微生物實(shí)驗(yàn)中的重要性。

［原理］

在我們的周圍環(huán)境中存在著大量微生物，其種類繁多、形態(tài)多樣、數(shù)量龐大。它們不但

廣泛分布于室內(nèi)外償二水和±填中，還分布。在新境中的所有物品上，±?是微生物棲

居的“大本營(yíng)”，它含有的微生物種類和數(shù)量最多；有些微生物附著于塵埃上漂浮于大氣中，

此外，人和動(dòng)物體的口腔、呼吸道和消化道及動(dòng)、植物體表面都存在著各種微生物。可以說(shuō)，微

生物是無(wú)孔不入、無(wú)處不在的。由于微生物個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和肉眼難以觀察，如果將這些微

生物通過(guò)某種方;懶幅0合適它們生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上，在適宜溫度下培養(yǎng)后可形成肉眼可見確

嘲體，此即為菌落。通過(guò)平板培養(yǎng)的方法可不境中微生物的數(shù)量。不同種的

小、形態(tài)各異的菌落，其可作為細(xì)菌種屬鑒定的礴。

［實(shí)瞼材料］

1.樣品土壤，自來(lái)水，污水，實(shí)驗(yàn)室或其他地方室內(nèi)空氣，物體或桌面表面，人皮膚

表面等。

2.培養(yǎng)基無(wú)菌普通瓊脂平板、無(wú)菌普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂瓶。

3.儀器和其他物品培養(yǎng)箱、酒精燈、試管架、水浴鍋、無(wú)菌生理鹽水（10mL、9mL、

5mL）,無(wú)菌吸管（1mL），無(wú)菌空平皿等。

［實(shí)瞼內(nèi)容］

1.標(biāo)記用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記樣品名稱、組別、日期等內(nèi)容或?qū)懺跇?biāo)簽紙上，貼

于皿底一側(cè)，避免影響結(jié)果觀察。

2.空氣中微生物的檢測(cè)

選擇適當(dāng)位置，打開無(wú)菌平板的皿蓋，使培養(yǎng)基暴露于空氣中一段時(shí)間，即讓空氣中

含微生物的塵?；蝾w粒以沉降法自然接種到培養(yǎng)基表面。一般為lOmin、30min.60min,

時(shí)間到后蓋上皿蓋，37℃24h培養(yǎng)?？蛇x擇同一地點(diǎn)不同時(shí)間或不同地點(diǎn)同一時(shí)間的不同

方式。

3.皮膚表面的細(xì)菌檢測(cè)

取無(wú)菌平板一塊，一分為二。一側(cè)用手指直接在培養(yǎng)基表面涂抹，洗手后再在另一側(cè)

涂抹，蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養(yǎng)。

4.桌面的細(xì)菌檢測(cè)

取無(wú)菌平板一塊，一分為二。一側(cè)用無(wú)菌棉簽在5mL鹽水管中浸濕后直接在培養(yǎng)基

表面涂抹，再用此棉簽涂抹桌面后在另一側(cè)涂抹，蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養(yǎng)。

5.土壤中微生物的檢測(cè)

取約1克土（離地表10cm處）于10mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻。靜置lOmin后，

做10倍遞增稀釋。選擇三個(gè)稀釋度，稀釋的同時(shí)各吸取1mL菌懸液于無(wú)菌空平皿中，傾

注，凝固后37℃24h倒置培養(yǎng)。

6.水中微生物的檢測(cè)

分別無(wú)菌吸取ImL自來(lái)水和污水于無(wú)菌的空平皿中，傾注，37℃24h倒置培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)六細(xì)菌的分離培養(yǎng)與移植

［目的］

掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)及移植的基本要領(lǐng)和方法。

［原理］

在細(xì)菌學(xué)診斷中，分離培養(yǎng)是不可缺少的一環(huán)。分離培養(yǎng)的目的主要是在含多種細(xì)菌的病料或培

養(yǎng)物中挑選出某種細(xì)菌。在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意：選擇適合于所分離細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、

氣體條件等。同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并做好標(biāo)記。

［實(shí)瞼材料］

菌種：大腸桿菌斜面、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)肉湯等。

器械：剪刀、記號(hào)筆（以上小組共用）。

培養(yǎng)基：普通肉湯和普通瓊脂斜面、普通瓊8旨平板、酒精燈、接種環(huán)（以上每人一套）。

［實(shí)覽內(nèi)容］

1.細(xì)菌的分離

（1）.平板劃線接種法通過(guò)在平板上劃線，將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面充分的分散開，使

單個(gè)細(xì)菌能固定在一點(diǎn)上生長(zhǎng)繁殖，形成單個(gè)菌落，以達(dá)到分離純種的目的。若需從平板上獲

取純種,則｝｝瞰一個(gè)單個(gè)菌落作純培養(yǎng)?？捎米龇蛛x純種細(xì)菌。

操作方法（三區(qū)劃線法）：

a、右手拿接種環(huán)，燒灼冷卻后，勾取菌種。

民左手抓握瓊脂平板（讓皿蓋留于桌上），在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以

免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂表面密集而不重疊的來(lái)回劃線，面積約占整個(gè)

平板的1/5-1/6,此為第一區(qū)。劃線時(shí)接種環(huán)與瓊脂呈30?40度角輕輕接觸，利用腕力滑

動(dòng)，切忌劃破瓊脂。

G接種環(huán)上多余的細(xì)菌可燒灼（每劃完一個(gè)區(qū)域是否需要燒灼滅菌視標(biāo)本中含菌量多少而

定），待冷后，在劃線末端重復(fù)2-3根線后，再劃下一區(qū)域（約占1/4面積），此為第二區(qū)。

&第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán)，用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個(gè)平皿。

e,劃線完畢，將平板扣入皿蓋并作好標(biāo)記，置37。（:溫箱孵育18?24小時(shí)觀察瓊脂表面菌落

分布情況，注意是否分離出單個(gè)菌落，并記錄菌落特征（如大小、吸透明度、色素等）。

平板分區(qū)劃線法培養(yǎng)后菌落分布情況

平板劃線培養(yǎng)的方法甚多，可按各人的習(xí)慣選擇應(yīng)用，其目的都是達(dá)到使被檢材料適當(dāng)神釋,

以求獲得獨(dú)立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不易鑒SOM菌落性狀。劃線培養(yǎng)時(shí)須注意以下

幾點(diǎn)：

a.整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作.

b.劃線前先將接種環(huán)稍稍彎曲，這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基。c.

劃線中不宜過(guò)多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔。

d.接種完畢后在皿底作好菌名、日期和接種者等標(biāo)記平皿倒扣，置37c培養(yǎng)。

(2).稀釋分離法也稱幅呈平板分離法有傾注培養(yǎng)法和涂布培養(yǎng)法兩種。

(3).利用化學(xué)藥品的分離法

a.抑菌作用：有些藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)另一些細(xì)菌則無(wú)效，故可利用此種

特性來(lái)進(jìn)行98菌的分離，例如通常在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或青霉素抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，以

分離革蘭氏陰性菌。

b.殺菌作用：將病料如結(jié)核病病料加入15%硫酸溶液中處理，其他雜菌皆被殺死，結(jié)核菌因

具有抗酸活性而存活.

c.鑒SU作用：根據(jù)細(xì)菌對(duì)翱糖具有分解能力，通過(guò)培養(yǎng)基中指示劑的變化來(lái)鑒BU野I細(xì)菌。例如

SS瓊脂培養(yǎng)基可以用做鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。

(4).實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離法

當(dāng)分離某種病原菌時(shí)，可將被檢材料注射于敏感性高的實(shí)動(dòng)物體內(nèi)，如將結(jié)核菌材料注射于豚

鼠體內(nèi)，雜菌不發(fā)育，而豚患慢強(qiáng)廢病而死。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死后，取心血或臟器用以分離細(xì)

菌。有時(shí)甚至可得到純培養(yǎng)。

2.細(xì)菌的培養(yǎng)

（1）.需氧性細(xì)菌的培養(yǎng)根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)特性給于合適的生長(zhǎng)環(huán)境大多數(shù)嗜體溫菌及病

原菌均能在37℃18-24h生長(zhǎng)良好.

（2）.厭氧性細(xì)菌的培養(yǎng)

厭氧菌需有較低的氧化一還原勢(shì)能才能生長(zhǎng)（例如破傷風(fēng)梭狀芽抱桿菌需氧化一還原電勢(shì)降低

至0.1IV時(shí)才開始生長(zhǎng)），在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化一還原電勢(shì)較高，不適于厭氧菌

的生長(zhǎng).為使培養(yǎng)基降低電勢(shì)，降低ig養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十^必要的.現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主

要有生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)3種方法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。a.生物學(xué)

方法

培養(yǎng)基中含有植物組織（如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等）或動(dòng)物組織（新鮮無(wú)菌的小片組織或加熱

殺菌的肌肉、心、畸），由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而懶氧氣（如肌肉或腦

組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這個(gè)原理），組織中所含

的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一還原電勢(shì)下降。

另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧i肖耗后，使厭氧菌能生

長(zhǎng)。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌（如枯草桿菌），另一僻種厭氧菌，

接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37c恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后，即可

觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。

b.化學(xué)方法利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收，或用還原氧化

型物質(zhì)，降低氧化一還原電勢(shì)。

李伏夫（B.MJIbbob）法此法系用連二亞硫酸納（Sod~Lkrnhydrosulphite）和碳酸鈉以吸

收空氣中的氧氣，其反應(yīng)式如下：

Na2S2O4+Na2C03+02-->Na2SO4+Na2SO3+C02

取T蓋郵,罐）旌TW層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)（如系液體培養(yǎng)基，則

直立于罐內(nèi)），最上端保留可容納1~2個(gè)平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1

000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g,在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少

許佛昆合物潮濕，但和阻濕，以免罐內(nèi)水分i修。若用無(wú)款娓，則可將平皿重疊正放在電底

容器上，以5罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水域嫻.

c.物理學(xué)方法

利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧狀

態(tài)，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育。

厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和McIntosh-Fildes二氏罐。將接種

好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存

的氧與氫經(jīng)的或杷的催化而化合成水，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放入孵育箱培養(yǎng)。

本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。

3.細(xì)菌的移植

將劃線分離培養(yǎng)37?C24h的平板從溫箱取出，到瞰單個(gè)菌落，經(jīng)染色鏡檢，證明不含雜菌，

此時(shí)用接種環(huán)｝｝瞰單個(gè)菌落,移植于瓊脂斜面tg養(yǎng)，得到的培養(yǎng)物，即為純培養(yǎng)物,再作其他各

項(xiàng)試驗(yàn)檢查和致病性試驗(yàn)等。具體操作方法如下：

Q）兩試管斜面移植時(shí)，左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管，使管口互相并齊，管底部放

由物副食指之間，松動(dòng)兩管棉塞，以骸幗容易拔出。右手持窗僻，在火焰上滅菌后，用右

手旨和無(wú)名指并齊同時(shí)拔出兩管棉塞，將管口迸行火焰滅菌，使其靠近火焰。將接種

環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先在無(wú)菌生長(zhǎng)的瓊脂±接觸使之冷卻，再另瞰少濟(jì)細(xì)菌后拉出接種環(huán)立即伸入

另一管斜面培養(yǎng)基上，勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部。從斜面底g際始劃曲線，向上至斜面

頂端為止，管口通過(guò)火焰滅菌，將棉塞塞好。蹄院畢，接種環(huán)通過(guò)火焰滅菌后放下接種器

最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接種者，置37P溫箱中培養(yǎng)。

(2).從平板培養(yǎng)基上選取可疑菌落移植到瓊脂斜面上作純培養(yǎng)時(shí)，則用右手執(zhí)接種棒，將接

種環(huán)火焰滅菌，左手打開平皿蓋,到瞰可疑菌落，左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，按上述方

磷亍蝴、腐。

(3).從斜面接種到液體培養(yǎng)基將已取有菌種的接種環(huán)伸入到液體培養(yǎng)基中，并使環(huán)在液

體與管壁接觸的部位輕輕摩露使菌體分散于液體中。接種后塞上棉塞將液體培養(yǎng)基輕輕晃

動(dòng)，使菌體均勻分布于液體中，以利生長(zhǎng)。

(4).從液體接種到液體培養(yǎng)基需用無(wú)菌移液器、移液管或吸管等。本實(shí)驗(yàn)室常用吸管。

取無(wú)菌吸管，除去上部包裝紙，在上端管口加橡皮頭，拔出管口棉塞，在火焰旁伸入菌種管

內(nèi)，吸取菌液，轉(zhuǎn)接到待接種的液體培養(yǎng)基內(nèi)。燒灼管口，塞好棉塞，進(jìn)行培養(yǎng)。

(5).液體接斜面方法同(1)

(6).半固體移植用穿剌法接種方法基本上與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，

垂直剌人培養(yǎng)基內(nèi)。要從培養(yǎng)基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。

實(shí)驗(yàn)七環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

［目的］

了解環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)