免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)修

《免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》

實(shí)驗(yàn)報(bào)告

姓名：姚麗君

專(zhuān)業(yè)：針灸推拿學(xué)

年級(jí)：2023年研究生

實(shí)驗(yàn)室：免疫實(shí)驗(yàn)室

時(shí)間：2023年1月12日

教師：李永念老師

免疫學(xué)教研室

人血清I的提取及鑒定

(一)重要原理：

二.離子互換層析提取人血清【gG：離子互換劑采用DEAE-纖維素，是表面交聯(lián)有二乙基

乙胺基團(tuán)的纖維素，自身帶有真電荷，能吸附陰離子。DEAE-纖維素懸浮在PH高于6.5,

克分子濃度低的緩沖液內(nèi)，置備成層析柱。人血清通過(guò)PH7.4磷酸緩沖液透析平衡后,

其中的IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其他的蛋白質(zhì)則重要帶負(fù)電荷，這樣的血清樣品

通過(guò)相同緩沖液平衡好的DEAE-纖維素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，僅

IgG最易形成吸附-解離-再吸附-再解離的狀態(tài)，因比能隨洗脫液一起最早從柱中流出,

收集洗脫液獲得IgGc

三.血清I鑒定：以收集的洗脫液為抗原，與兔抗人IgG做瓊脂雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)沉淀線(xiàn)

的形成擬定IgG抗原性。用免疫電泳法使血清中各種蛋白的分子大小以及電荷狀態(tài)、

電荷量均有差異，因而它們的泳動(dòng)速率也不相同，根據(jù)在凹槽中加入免抗人血清，上下

兩孔加入用蔗糖包埋法進(jìn)行濃縮后的濃縮液和正常人血清，經(jīng)一段時(shí)間后出現(xiàn)沉淀弧,

根據(jù)沉淀弧的情況來(lái)檢測(cè)所獲的IgG的純度。用754型分光光度計(jì)于280nm紫外光源

測(cè)定洗脫液光密度值.根據(jù)IgG的Elcml%=14.3(OD)公式，可計(jì)算出收獲的IgG含量,

并推算出所獲得IgG的百分率。

1.重要材料：

2.0.5NNaOH、0.5NHCL、0.85%NaCL按常規(guī)配制

3.DEAE-纖維素健康人全血

4.PH7.40.01M磷酸緩沖液

5.20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制

6.蔗糖（研成細(xì)粉狀）

7.PH8.60025MBA巴比妥納-巴比妥緩沖液,2MNaCL水溶液

8.1.5%瓊脂凝膠

布氏漏斗、抽濾瓶、水泵、試管，燒杯，玻璃棒，濾紙?jiān)嚰?、蝴蝶鐵架、透析袋、離心機(jī),746?

電泳儀、754型分光光度計(jì)

三、操作環(huán)節(jié)：

1、（-）DEAE-纖維素預(yù)解決：

2、稱(chēng)取DEAE-纖維素12克，均勻撒在事先盛有150ml0.5NNaOH的燒杯中，人其

自由沉降，放置4U—50分鐘，不時(shí)地用玻璃棒輕輕攪動(dòng)。

3、將湖狀物移入墊有濾紙的布氏漏斗中，連接漏斗抽濾瓶，并用水泵抽干糊狀物。

立即將DEA6纖維素移入燒杯中，加蒸儲(chǔ)水，浸泡20-30min并不時(shí)攪拌，再移

入漏斗抽干，如此反復(fù)，至洗出的PH值等于8即可。

（二）將互換劑移入150ml0.5NHCL中放置40-50min,不時(shí)輕輕攪動(dòng).移入布氏漏斗抽

濾，再依同法用0.5NNaOH解決一次，時(shí)間不超過(guò)50min。

（三）重第2項(xiàng)操作，至抽灌液PH值等于8即可，最后PH7.40.01MPB液浸泡互換劑,

抽干，再反復(fù)一次，然后將互換劑用相同PB調(diào)成糊狀，保存至裝柱。

（四）裝柱、平衡

（五）固定層析柱在蝴蝶鐵架上，垂直。柱上方放置PH7.40.01MPB液的洗脫瓶，以乳

膠管相連，柱底部有細(xì)膠管，裝止水夾，調(diào)節(jié)流速。

（六）將上糊狀物傾入柱中，打開(kāi)柱底流出口，用燒壞接流出液，注意不能斷層，纖維素

中不允許進(jìn)空氣，柱上表面要平，上部要留有約3cm高空間。

（七）上樣和洗脫

1、將人血置離心機(jī)以2023rpm,lOmin離心，取出并用毛細(xì)吸管吸取10ml人血清裝

入透析袋，于燒杯內(nèi)浸入40倍于血清體積的起始緩沖液中，置4℃冰箱內(nèi)透析過(guò)

夜，半途更換兩次緩沖液；

2、打開(kāi)柱上端塞子，用帶有橡皮乳頭的毛細(xì)吸管吸出互換劑表面的緩沖液，至仍

2mm厚的液面，以免空氣進(jìn)入；

3、用清潔細(xì)吸管將已平衡好的血清樣本原柱管內(nèi)壁緩緩加在纖維素柱表面，調(diào)節(jié)

流速，使樣品進(jìn)入互換柱內(nèi)，約3ml/lOmin;

4、待液面還約2mm厚的樣品時(shí)，用少量起始PB沖洗柱內(nèi)壁，到PB進(jìn)入互換劑仍

留有2mm后液面時(shí)，再?zèng)_洗二次，保持柱面平整；

（八）最后加適量起始緩沖液，連接洗脫瓶，流速調(diào)至30.40ml/cm2/h;

（九）收集洗脫液與試管中，每管5ml,共收集12管。并從各管中取1-2滴，加20%三氯

醋酸1-2滴檢測(cè)。

（十）洗脫液抗原性鑒定

用1.5%瓊脂凝膠制版，根據(jù)下圖用打孔器打孔：

(-1—)加樣：中心孔加入兔抗人IgG從收集的12管洗脫液中用毛細(xì)吸管吸取洗脫液

分別加入周邊六孔，每孔所加樣品的量以液面與孔測(cè)平齊為準(zhǔn);

（十二）將瓊脂板置海盒內(nèi)37c溫箱孵育24小時(shí)，觀(guān)測(cè)結(jié)果。

（十三）IgG純度鑒定

瓊脂板制作：用1.5%瓊脂凝膠加熱融化后傾注在載玻

片上，玻片上放一條細(xì)玻棒，等凝膠凝固后在玻棒上下

兩側(cè)打孔，制成如圖所示：

1、洗脫液的解決：將通過(guò)離子互換層析法收集的12管洗脫液，用754型分光光度

計(jì)測(cè)各管洗脫液在波長(zhǎng)280nm的光密度值，第一個(gè)蛋白峰為IgG,收集有IgG活

性的三管洗脫液，混合后裝于透析袋內(nèi)，用蔗糖粉末將其包埋使其濃縮；

2、加樣：如圖示上孔加入濃縮的IgG提取液，入孔加入正常人血清，將加樣后的瓊

脂板置于746-電泳儀上，用四層紗布條做橋，連接凝膠板與電極緩沖液。該橋搭

在凝膠上部分約5mm,盡量拉直，與膠面間不能有氣泡；

3、連接電源，調(diào)節(jié)指示電壓至100V(端壓約為5V/cm),電泳槽加蓋后，電泳至血

清蛋白遷移至距正極段邊沿1cm處，關(guān)閉電源；

凝膠板與桌面，取出玻條，凝膠中部既成一長(zhǎng)槽，加兔抗人全血清加入槽內(nèi)與膠面水

平；

置凝膠板與濕盒內(nèi)，于37c或室溫中孵育，12小時(shí)觀(guān)測(cè)沉淀弧出現(xiàn)的情況。

7、計(jì)算回收率:取透析袋內(nèi)濃縮的提取液，用754型分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)280的光密度值，假

如超過(guò)測(cè)定范圍，稀釋后再測(cè)，按濃縮后IgG(mg/ml)=OD280X1.43X|可收體積，正常人血清

IgG:12(mg/ml)X收集的血清體積，回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG,計(jì)算回收率。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

LDEAE-纖維素洗說(shuō)，收集洗脫液12管，均為略帶黃色的液體，取樣添加20%三氯醋

酸，各管中僅第4、5管出現(xiàn)渾濁，表白試管洗脫液中含蛋白質(zhì)。其余管未見(jiàn)明顯反

映。

745型分光光度計(jì)測(cè)出12管洗脫液的光密度(OD)值如下：

管數(shù)123456789101112

A28O0.0240.0322.853.()42.650.660.192().155().133().113().11()0.110

做

A280

光密

度值

峰值

曲線(xiàn)

圖如

下：

A280

(試管數(shù))

a)通過(guò)蔗糖粉末包埋后，收集到濃縮的IgG為3.5ml,測(cè)其OD值為3.52,此值

已經(jīng)超過(guò)光密度計(jì)測(cè)定范圍，取0。5ml濃縮液加2.5ml生埋鹽水稀釋5倍

后測(cè)OD值為2.52。

按下列方法計(jì)算IgG回收率：

濃縮后IgG：C(mg/ml)=OD280X1.43X體積(3.5X5)

正常人血清IgG:12(mg/ml)X體積(8ml)

回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG

=2.52x1.43x3.5x5/12x8

=65.69%

向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖，有白色成沉淀線(xiàn)出現(xiàn)，彼此互相融合相連。

疫電泳(純度鑒定)如下圖，有沉淀弧出現(xiàn)，提取液與抗人全血清之間只出現(xiàn)一條沉淀弧，并

靠近凝膠板負(fù)極端，說(shuō)明所提取IgG為純品。人血清與抗人血清之間由于存在多抗原抗體成

分，所以出現(xiàn)多條沉淀弧。

五、分析與討論:

IgG是一種具有抗體活性的免疫球蛋白，其具有一般蛋白質(zhì)的通性，是再次體液免疫應(yīng)

答產(chǎn)生的重要Ig。IgG重要由脾臟和淋巴結(jié)中漿細(xì)胞合成，含量高（在血清中含量最高），分

布廣，它能與抗原特異性結(jié)合，從而在體內(nèi)介導(dǎo)多種生理和病理效應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)是運(yùn)用離子互換劑的特性，血清中IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其它的蛋白

質(zhì)則重要帶負(fù)電荷，使人血清通過(guò)帶陽(yáng)禽子DEAE-纖維素制成的互換劑，帶負(fù)電荷的蛋白

質(zhì)與陽(yáng)離子互換劑結(jié)合，而不帶電荷的IgG處在游離狀態(tài)，用PH7.4的磷酸緩沖液通過(guò)層析

柱，未結(jié)合的IgG隨洗脫液一起流出，試管收集，這樣使血清樣品通過(guò)DEAE-纖維柱而得

以分離出IgG。收集的洗脫液顏色略帶黃色，也許是收集血清時(shí)吸入了破碎的紅細(xì)胞。在加

入三氯醋酸后4.5管出現(xiàn)沉淀，說(shuō)明從第4管開(kāi)始有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3.4.5

三管，并峰值上升和下降不久，未見(jiàn)饅頭峰，證明洗脫較好。

本次實(shí)驗(yàn)己成功地收集了IgG,從雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，中間孔抗人IgG與周邊

孔的提取液IgG之間的凝膠出現(xiàn)一條白色沉淀線(xiàn),3、4、5孔之間形成的沉淀線(xiàn)互相吻合，這

說(shuō)明IgG與抗體抗人IgG濃度相稱(chēng)，提取液為單一抗原，即IgG。通過(guò)免疫電泳結(jié)果看：在

滴加濃縮提取液的一測(cè)出現(xiàn)一條沉淀弧，說(shuō)明濃縮提取液中只有一種抗原物質(zhì)，而在滴加正

常人血清的一測(cè)出現(xiàn)多條沉淀弧，說(shuō)明正常人血清中存在多種抗原物質(zhì)。所以，通過(guò)以上兩

個(gè)實(shí)驗(yàn)證明：經(jīng)分離提取的為純IgG。

根據(jù)回收率看本實(shí)驗(yàn)的提取及回收比較有效，亦可根據(jù)公式計(jì)算IgG的濃度為

18.018mg/mU

實(shí)驗(yàn)七抗體形成細(xì)胞的檢測(cè)

一、脾細(xì)胞介導(dǎo)的羊紅細(xì)胞分光光度計(jì)定量測(cè)定法（QHS）

二、重要原理

將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液，與一定量的綿羊紅細(xì)胞在試管內(nèi)混合，加入

適量補(bǔ)體，在水浴中孵育一定期間，在補(bǔ)體的參與下，引起抗體形成細(xì)胞周邊的綿羊紅細(xì)胞

溶解，并且溶血的限度與脾細(xì)胞中的抗體形成細(xì)胞總數(shù)有一定的關(guān)系，與抗體形成細(xì)胞所分

泌的抗體量有關(guān)，但不能反映單個(gè)抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量。因抗體形成細(xì)胞上有抗綿羊紅細(xì)胞

抗體，與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，在補(bǔ)體的激活下，綿羊紅細(xì)胞溶解，故抗SRBC抗體又稱(chēng)溶血素。

通過(guò)一?定量SRBC完全溶解的最高血清稀釋度得到溶血素的效價(jià)。QHS法可用于檢測(cè)藥物

對(duì)SRBC誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生過(guò)程是否有刺激作用和克制作用。

三、重要材料

1、SRBC保存液，預(yù)先洗三次，配置為0.5%、1%濃度的SRBC

2、Balb/c小鼠（體重25左右，雌雄隨機(jī)），免疫與未免疫小鼠各6只

3、0.01MPH7.2PBS（含Ca2+,Mg2+）,生理鹽水

4、補(bǔ)體（預(yù)先制備好的，需稀釋成1：30）,熒光標(biāo)記的免疫小鼠IgG

其他：水浴箱、離心機(jī)、試管、玻片、毛細(xì)吸管、組織研磨器等

四、操作環(huán)節(jié)

1.先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于清潔干燥試管內(nèi)、待血液凝固后，置恒溫箱37c內(nèi)

30min,血清析出,并收集與小管保存,以備測(cè)溶血素;

2.頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔，用PBS清洗，用組織研磨器研磨置備單細(xì)胞懸浮液（每個(gè)

脾臟加5mlNS）,然后離心（2023轉(zhuǎn)/分）lOmin,棄上清夜，再加生理鹽水離心,如此反復(fù)3

次，各管最后留下的沉淀分別加生理鹽水至8ml備用；

3、取6個(gè)試管，設(shè)1、2、5號(hào)為免疫后的小鼠,3號(hào)為未免疫小鼠,4、6號(hào)不裝入脾細(xì)胞，然

后按如下操作，混勻，置水浴箱30min,目測(cè)結(jié)果如下：

單位（ml）

編號(hào)脾細(xì)胞SRBC補(bǔ)體(1:30)PBCFI測(cè)結(jié)果

(5X106)/ml(0.5%)

1-21（免疫鼠）11—清

31（未免疫鼠）11—混濁

4—111混濁

51（免疫鼠）1—1混濁

6—1—2混濁

4.溶血素效價(jià)的測(cè)定：

2）1）取前血清制備測(cè)血清，離心；

取前制備免疫小鼠，取0.1ml于第一試管中，再加入0.9NS1ml,混勻從中取0.5ml加入第二

個(gè)試管中，再力口0.5mlNS,混勻，取0.5ml加入第三管中，繼續(xù)如此加至第9管，稀釋后取出

0.5ml丟棄,最后一管只加NS,然后再于各管中加入0.5ml補(bǔ)體（1:30）和0.5ml1%SRBC,搖

勻,于37℃水浴30min,取出后看結(jié)果。方法與結(jié)果如下:

管數(shù)123乙56789101112131415

對(duì)

/昭、、、

組

小鼠0.10.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5-

血清

NS0.90.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5

補(bǔ)體0.50.5