油脂脂肪酸組成的測定外標(biāo)法歸一化法73課件

油脂脂肪酸組成的測定——外標(biāo)法、歸一化法主講教師：王旭峰農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)員2學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握外標(biāo)法、歸一化法測定脂肪酸組成的基本原理；掌握外標(biāo)法、歸一化法測定脂肪酸組成中試樣制備方法；掌握脂肪酸組成測定中試樣前處理的方法；掌握脂肪酸組成測定中數(shù)據(jù)處理及計(jì)算方法；掌握脂肪酸組成測定過程中的注意事項(xiàng)。3一、測定原理水解-提取法：試樣經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，經(jīng)毛細(xì)管柱氣相色譜分析，外標(biāo)法定量測定脂肪酸的含量。動(dòng)植物油脂試樣不經(jīng)脂肪提取，直接進(jìn)行皂化和脂肪酸甲酯化。酯交換法(適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂)：將油脂溶解在異辛烷中，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應(yīng)完全后，用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀,外標(biāo)法定量測定脂肪酸的含量。乙酰氯-甲醇法(適用于含水量小于5%的乳粉和無水奶油試樣):乙酰氯與甲醇反應(yīng)得到的鹽酸-甲醇使其中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，經(jīng)氣相色譜儀分離檢測，外標(biāo)法定量。4二、試劑與材料（一）試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。1.鹽酸(HCl)。2.氨水(NH3·H2O)。3.焦性沒食子酸(C6H6O3)。4.乙醚(C4H10O)。5.石油醚：沸程30℃~60℃。6.乙醇(C2H6O)(95%)。7.甲醇(CH3OH)：色譜純。8.氫氧化鈉(NaOH)。5二、試劑與材料（一）試劑9.正庚烷[CH3(CH2)5CH3]：色譜純。10.三氟化硼甲醇溶液,濃度為15%。11.無水硫酸鈉(Na2SO4)。12.氯化鈉(NaCl)。13.無水碳酸鈉(Na2CO3)。14.甲苯(C7H8):色譜純。15.乙酰氯(C2H3ClO)。16.異辛烷[(CH3)2CHCH2C(CH3)3]:色譜純。17.硫酸氫鈉(NaHSO4)。18.氫氧化鉀(KOH)。6二、試劑與材料（二）試劑配制1.鹽酸溶液(8.3mol/L)：量取250mL鹽酸，用110mL水稀釋，混勻，室溫下可放置2個(gè)月。2.乙醚-石油醚混合液(1+1)。3.氫氧化鈉甲醇溶液(2%)。4.飽和氯化鈉溶液：稱取360g氯化鈉溶解于1.0L水中，攪拌溶解，澄清備用。7二、試劑與材料（二）試劑配制5.氫氧化鉀甲醇溶液(2mol/L)：將13.1g氫氧化鉀溶于100mL無水甲醇中，可輕微加熱，加入無水硫酸鈉干燥，過濾,即得澄清溶液。6.乙酰氯甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%)：量取40mL甲醇于100mL干燥的燒杯中，準(zhǔn)確吸取5.0mL乙酰氯逐滴緩慢加入，不斷攪拌，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移并定容至50mL干燥的容量瓶中。臨用前配制。注：乙酰氯為刺激性試劑，配制乙酰氯甲醇溶液時(shí)應(yīng)不斷攪拌防止噴濺，注意防護(hù)。8二、試劑與材料（二）標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（1）脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%。（2）單個(gè)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。將單個(gè)脂肪酸甲酯分別從安瓿瓶中取出轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，用正庚烷沖洗安瓿瓶，再用正庚烷定容，分別得到不同脂肪酸甲酯的單標(biāo)溶液，貯存于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。（3）脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)試樣中所要分析脂肪酸的種類選擇相應(yīng)甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲苯配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-10℃以下的冰箱中保存，有效期3個(gè)月。9三、儀器設(shè)備（1）勻漿機(jī)或?qū)嶒?yàn)室用組織粉碎機(jī)或研磨機(jī)。（2）氣相色譜儀。具有氫火焰離子檢測器（FID）。（3）毛細(xì)管色譜柱。聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定相，柱長100m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.2μm。（4）恒溫水浴。控溫范圍40~100℃控溫精度±1℃。（5）分析天平。感量0.1mg。（6）離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥5000r/min。（7）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。（8）螺口玻璃管(帶有聚四氟乙烯做內(nèi)墊的螺口蓋)：15mL。（9）離心管：50mL。10四、操作流程制備樣品→稱樣→水解試樣→提取油脂→制備脂肪酸甲酯→色譜分離→結(jié)果計(jì)算五、測定步驟（一）制備試樣固體或半固體試樣使用組織粉碎機(jī)或研磨機(jī)粉碎，液體試樣用勻漿機(jī)打成勻漿，-18℃以下冷凍保存。測定時(shí)，將其解凍后使用。11五、測定步驟（二）試樣前處理（水解-提取法）1.試樣的稱取稱取0.1~10g（精確至0.1mg，約含脂肪100~200mg）均勻試樣于250mL平底燒瓶中，加入約100mg焦性沒食子酸、幾粒沸石、2mL95%乙醇、混勻。根據(jù)試樣的類別選取不同的水解方法。12五、測定步驟2.水解試樣根據(jù)試樣的類別選取相應(yīng)的水解方法。（1）酸水解于試樣中加入10mL鹽酸溶液，混勻。將燒瓶放入70~80℃水浴中水解40min。每隔10min振蕩一次燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。乳粉及液態(tài)乳堿水解法乳酪酸-堿水解法其他試樣酸水解法13五、測定步驟（2）堿水解（乳制品(乳粉及液態(tài)乳等試樣)于試樣中加入氨水5mL，混勻。將燒瓶放入70~80℃水浴中水解20min。每隔5min振蕩一次燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。（3）酸-堿水解（乳酪）于試樣中加入氨水5mL，混勻。將燒瓶放入70~80℃水浴中水解20min。每隔10min振蕩一次燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。再加入10mL鹽酸，繼續(xù)水解20min，每10min振蕩一次燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。14五、測定步驟3.提取脂肪試樣水解后加入10mL95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用50mL乙醚-石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5min，靜置10min。將醚層提取液收集到250mL燒瓶中。用乙醚-石油醚混合液重復(fù)提取水解液3次，最后用乙醚-石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集到250mL燒瓶中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。15五、測定步驟4.脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化于脂肪提取物中加入8mL2%氫氧化鈉甲醇溶液，連接回流冷凝器，80℃±1℃水浴上回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7mL15%三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流2min。用少量水沖洗回流冷凝器，停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入10~30mL正庚烷，振搖2min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取約5mL上層正庚烷提取溶液于25mL試管中，加入約3~5g無水硫酸鈉，振搖1min，靜置5min，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中，待測。16五、測定步驟（二）試樣前處理（乙酰氯-甲醇法）1.試樣稱取準(zhǔn)確稱取乳粉試樣0.5g或無水奶油試樣0.2g(均精確到0.1mg)于15mL干燥螺口玻璃管中，加入5.0mL甲苯。2.甲酯制備及標(biāo)準(zhǔn)測定液制備加入4mL異辛烷溶解試樣,必要時(shí)可以微熱使試樣溶解后加入200μL氫氧化鉀甲醇溶液,蓋上玻璃塞猛烈振搖30s后靜置至澄清。加入約1g硫酸氫鈉,猛烈振搖,中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后,將上層溶液移至上機(jī)瓶中,待測。17五、測定步驟（二）試樣前處理（酯交換法）1.試樣稱取稱取試樣60.0mg至具塞試管中,精確至0.1mg。2.試樣測定液的制備向試樣中加入10%乙酰氯甲醇溶液6mL，充氮?dú)夂?，旋緊螺旋蓋。振蕩混合后于80℃±1℃水浴中放置2h，期間每隔20min取出振搖1次，水浴后取出冷卻至室溫。將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，分別用3mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于50mL離心管中，混勻。5000r/min離心5min。取上清液作為試液，氣相色譜儀測定。18五、測定步驟（三）脂肪酸甲酯測定1.色譜參考條件（1）毛細(xì)管色譜柱。聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定相，柱長100m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.2μm。（2）進(jìn)樣器。溫度270℃。（3）檢測器。溫度280℃（4）柱溫程序。初始溫度100℃，持續(xù)13min；100~180℃，升溫速率10℃/min，保持6min；180~200℃，升溫速率1℃/min，保持20min；200~230℃，升溫速率4℃/min，保持10.5min。19五、測定步驟1.色譜參考條件（5）載氣。氮?dú)狻＃?）分流比。100∶1。（7）進(jìn)樣體積。1.0μL （8）測定條件。應(yīng)滿足理論塔板數(shù)n≥2000/m、分離度R≥1.25。20六、結(jié)果計(jì)算與表述

21六、結(jié)果計(jì)算與表述

22六、結(jié)果計(jì)算與表述

23七、說明（1）內(nèi)標(biāo)法是色譜定量比較準(zhǔn)確的方法，既不需要嚴(yán)格控制進(jìn)樣體積，也不需要所有脂肪酸甲酯全部出峰。但是，試樣和內(nèi)標(biāo)物需要精確稱量。（2）內(nèi)標(biāo)物應(yīng)選擇試樣中不含有的物質(zhì)。常用于食品脂肪酸測定的內(nèi)標(biāo)物有十一碳酸甘油三酯、十三碳酸甘油三酯、十九碳酸甘油三酯、二十三碳酸甘油三酯，可根據(jù)實(shí)際工作需要選擇。對于脂肪酸組成不確定的試樣，首先不加內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行其脂肪酸甲酯分析，觀察在擬選擇的內(nèi)標(biāo)物峰處是否有干擾峰出現(xiàn)。如果出現(xiàn)干擾峰，選擇其他內(nèi)標(biāo)物。24七、說明（3）本方法提供的色譜分離條件，僅為參考條件。對于不同生產(chǎn)商提供的儀器、色譜柱，應(yīng)考核其色譜分離效能。滿足理論塔板數(shù)n≥2000/m、分離度R≥1.25時(shí)，才能進(jìn)行正常的測定。否則，需要對色譜條件進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。25七、說明（4）不同種類的試樣，采用不同的方法制備脂肪酸甲酯。糧食及其制品、油料等試樣，經(jīng)酸水解提取油脂后，采用三氟化硼甲醇法、酯交換法制備脂肪酸甲酯。對于游離脂肪酸含量不高于2%的油脂試樣，可直接采用酯交換法制備脂肪酸甲酯。對于游離脂肪酸含量高于2%的動(dòng)植物油脂、脂肪酸、脂肪酸鹽等試樣，可采用三氟化硼甲醇法制備脂肪酸甲酯。但是，三氟化硼甲醇法不適用于含次氧基（如羥基、氫過氧基、酮基、環(huán)氧基）、環(huán)丙烷及環(huán)丙烯基、共軛多不飽和烯基脂肪酸及炔類脂肪酸的甲酯制備。26七、說明（5）所用試劑不得產(chǎn)生干擾脂肪酸甲酯峰的雜峰，特別是三氟化硼甲醇溶液，在20~22碳脂肪酸甲酯峰區(qū)域可能出現(xiàn)雜峰。使用新購置的三氟化硼甲醇溶液時(shí)，都應(yīng)做純脂肪酸甲酯制備、色譜分離試驗(yàn)。如果出現(xiàn)雜峰干擾，應(yīng)更換該批試劑。（6）采用皂化-三氟化硼甲醇法制備脂肪酸甲酯時(shí)，其操作應(yīng)注意：三氟化硼易揮發(fā)、強(qiáng)腐蝕、有毒。應(yīng)在通風(fēng)櫥里進(jìn)行甲酯化操作，采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施以保護(hù)眼睛，使用過的玻璃器具，應(yīng)立即用水沖洗。建議操作入員盡量不用甲醇和三氟化硼制取三氟化硼甲醇溶液，可購置14%或50%三氟化硼甲醇溶液使用。27七、說明注意：三氟化硼甲醇溶液制備方法將裝有1L甲醇的2L燒瓶置于冰水浴中，冷卻后稱重。同時(shí)，用玻璃管將鋼瓶中的三氟化硼導(dǎo)入甲醇溶液中，直至吸收125g三氟化硼為止。在玻璃管浸入甲醇溶液中之前至取出，都應(yīng)通以三氟化硼氣體，以防液體回流。三氟化硼氣體通入甲醇溶液中時(shí)，流量太大不能實(shí)全溶入，使燒瓶中三氟化硼大量逸出而產(chǎn)生白煙。三氟化硼甲醇溶液于冰箱中保存，可使用兩年。28七、說明在提取油脂、制備脂肪酸甲酯時(shí)，濃酸、濃堿、高溫條件下有氧存在，不飽和脂肪酸很容易氧化，試樣中加入抗氧化劑焦性沒食子酸，可以保護(hù)不飽和脂肪酸。對于多不飽和脂肪酸含量高的試樣，在加熱處理前，于試劑以及燒瓶、冷凝回流管等容器中充入氮?dú)庵脫Q空氣，可免脂肪酸氧化。脂肪酸甲酯制備完成后，加入飽和氯化鈉溶液，其鹽析作用破除乳化，使水相與有機(jī)相快速分離，脂肪酸甲酯更快聚集并溶入正庚烷中。從甲酯化溶液中分取出正庚烷層后，加無水硫酸鈉干燥時(shí)，最好加蓋密閉。29七、說明當(dāng)試樣中不皂化物含量較高時(shí)，可能會影響脂肪酸甲酯分離。用蒸餾水稀釋皂化液，并用乙醚、已烷或石油醚除去不皂化物，然后酸化皂化液、提取脂肪酸，再進(jìn)行甲酯制備。氣相色譜分析時(shí)，使用異辛烷作溶劑制得的甲酯溶液回收率最高，但對已酸甲酯的回收率僅有75%。30七、說明（7）氫氧化鉀甲醇法屬于堿催化酯交換法，需在無水條件下進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)體系中有水存在時(shí)，堿性介質(zhì)能促使脂肪酸甲酯水解。因此，配制氫氧化鉀甲醇溶液時(shí)，生成甲醇鉀產(chǎn)生的水需要用無水硫酸鈉脫除，甲醇溶劑也應(yīng)使用無水甲醇。此外，試樣也需要干燥處理。（8）酯交換法只能用于甘油三酯的脂肪酸甲酯化，游離脂肪酸及鹽不能被甲酯化。未甲酯化的脂肪酸進(jìn)入色譜柱后，造成色譜柱污染。即使試樣中游離脂肪酸含量不大于2%，長期用于測定酯交換法制備的脂肪酸甲酯，色譜柱柱效很快降低。31七、說明（9）脂肪酸甲酯制備完成后，加硫酸氫鈉生成硫酸鉀、硫酸鈉，既中和了剩余的氫氧化鉀，