儀器分析項目五高效液相色譜分析94課件

儀器分析項目五

高效液相色譜分析認(rèn)識高效液相色譜法1認(rèn)識高效液相色譜儀2掌握高效液相色譜儀的應(yīng)用3概念與特點分離類型認(rèn)識高效液相色譜法11.2.1液-固吸附色譜法液-固吸附色譜法是以固體吸附劑作固定相，被分離物質(zhì)在固定相吸附力大小的不同而實現(xiàn)分離的方法。固定相極性：硅膠、氧化鋁等，其中全多孔型硅膠微粒固定相使用最廣泛。非極性：活性炭等。流動相極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用極性較低的流動相。特別適宜于分離異構(gòu)體。具體為偶氮染料、維生素、極性小的植物色素等。分離原理1.2.2液-液分配色譜法分離原理液-液分配色譜法是根據(jù)物質(zhì)在兩種不互溶（或部分互溶）的液體中溶解度的不同而實現(xiàn)分離的方法。將特定的液態(tài)（固定液）涂漬在惰性載體（擔(dān)體）表面制備固定相，與流動相組成液液兩相。組分分離時依據(jù)不同的組分在互不相溶的兩相中分配系數(shù)不同，因而溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。固定液易被流動相漸漸溶解而流失，流動相流速不能高，不能采用梯度洗脫，柱的重復(fù)性、穩(wěn)定性不好，使用受限。1.2.3鍵合相色譜法定義化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）是采用將固定液利用化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面上，使其形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相的液相色譜法。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有80%的分離問題可以用鍵合相色譜法解決。十八烷基硅烷(ODS)鍵合相1.2.3鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相類型載體：廣泛使用全孔型或薄殼型微粒硅膠。鍵合反應(yīng)：硅烷化反應(yīng)、硅酸酯化反應(yīng)類型：非極性鍵合相（鍵合ODS或C18等非極性基團(tuán)）

極性鍵合相（鍵合-NH2、-CN、醇基等極性基團(tuán)）

離子型鍵合相（鍵合季銨鹽、磺酸基等可交換陰或陽離子基團(tuán))據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜分析任務(wù)中，約有80%由C18反相鍵合相解決。1.2.3鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法特征——固定相極性＞流動相極性固定相——-NH2、-CN等極性鍵合相流動相——非極性或弱極性溶劑（如正己烷）+適量極性溶劑（如乙腈、

三氯甲烷、醇等混合溶劑分離機制——類似液-液分配色譜的分離原理應(yīng)用范圍——分離溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物

1.2.3鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法特征——固定相極性＜流動相極性固定相——ODS（C18）或辛烷基硅烷（C8）等非極性或弱極性鍵合相流動相——水+有機調(diào)節(jié)劑（如水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇-無機鹽緩沖液等）分離機制——“疏溶劑作用”理論應(yīng)用范圍——適用于分離非極性至中等極性的分子型化合物

1.2.3鍵合相色譜法1-對羥基苯甲酸甲酯2-對羥基苯甲酸乙酯3-對羥基苯甲酸丙酯4-對羥基苯甲酸丁酯當(dāng)溶質(zhì)分子的極性一定時，若增大流動相的極性（水相比例增大），則降低流動相對溶質(zhì)分子的洗脫能力，使溶質(zhì)的分配比增大，保留時間增大；反之亦然。固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。反相色譜分離實例1.2.3鍵合相色譜法流動相要求：（1）純度要高：色譜純→過濾（0.45μm有機膜）→脫氣；

（2）對色譜柱、固定相和分離組分要有惰性；

（3）對樣品要有適宜的溶解度；

（4）與檢測器要相匹配：紫外檢測器：要求流動相在紫外區(qū)吸收很弱；

示差折光檢測器：要求流動相與樣品組分的折光率相差較大。常用溶劑極性順序：水>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>四氫呋喃>二氯甲烷實際上采用適當(dāng)比例的二元混合溶劑可適應(yīng)不同類型的樣品分析，有時采用三元甚至四元混合溶劑以獲得最佳分離。實際使用中，采用甲醇-水體系已能滿足多數(shù)樣品的分離要求。1.2.4離子色譜法離子色譜法是利用不同待測離子對固定相上的交換基團(tuán)親和力差別而實現(xiàn)分離。定義1.2.4離子色譜法分離原理抑制型（雙柱型）交換反應(yīng)：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脫反應(yīng)：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX與組分反應(yīng)：R-H++NaX→R-Na++HX與洗脫劑反應(yīng)：R-H++NaOH→R-Na++H2O加了抑制柱后，進(jìn)入檢測器的本底是電導(dǎo)率很低的水，因此很容易檢測出具有較大電導(dǎo)率的HX。分離柱抑制柱1.2.4離子色譜法分離原理非抑制型（單柱型）使用更低交換容量的固定相，常使用濃度很低、電導(dǎo)率很低的流動相，如0.1-1.0mmol/L的苯甲酸、鄰苯二甲酸或它們的鹽溶液。由于本底電導(dǎo)較低,試樣離子被洗脫后可直接被電導(dǎo)檢測器所檢測。1.2.4離子色譜法固定相實際上是離子交換劑，離子交換基團(tuán)+基質(zhì)上。基質(zhì)：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。類型：陽離子和陰離子交換劑。前者用于分離堿性化合物，后者用于酸性化合物。類型符號官能團(tuán)強陽離子交換劑SCX—SO3H弱陽離子交換劑WCX—COOH強陰離子交換劑SAX—N+R3弱陰離子交換劑WAX—NH21.2.4離子色譜法流動相大都采用水緩沖溶液，有時用有機溶劑+水緩沖溶液。增加流動相中鹽的濃度，可以降低待測離子的競爭親和力，使其在固定相上的保留時間減少，先出色譜柱；反之，則保留時間增大，后出色譜柱。pH增大，酸的離解度增大，保留時間增加，后出柱；有機堿的離解度降低，保留時間減小，先出柱。緩沖溶液中緩沖劑濃度增大，保留時間會減小。1.2.5凝膠色譜法凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法，它是以多孔凝膠為固定相，利用流動相中各組分的相對分子質(zhì)量不同（分子尺寸大?。┒垢鹘M分分離。分離原理小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。1.2.5凝膠色譜法分離過程1-分子大小不同的混合物上柱；2-洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3-大小分子分開；4-大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中。1.2