貝類 脂溶性海洋生物毒素的檢測 液相色譜-串聯(lián)質譜法

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貝類脂溶性海洋生物毒素的檢測

液相色譜-串聯(lián)質譜法

警示—為避免毒素的危害，應戴手套進行操作。移液管及移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液等應

在次氯酸鈉溶液（5%）浸泡1h以上以使毒素分解。

1范圍

本標準規(guī)定了貝類脂溶性海洋生物毒素大田軟海綿酸、鰭藻毒素、蛤毒素、蝦夷扇貝毒素、原多甲

藻酸毒素、環(huán)亞胺毒素等11個毒素化合物的液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法原理、操作步驟及結果計算等。

本標準適用于貝類體中脂溶性海洋生物毒素的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

3原理

貝類樣品經甲醇提取，堿性條件下水解釋放酯化態(tài)生物毒素部分，用HLB固相萃取柱凈化，液相色

譜分離，串聯(lián)質譜測定，外標曲線法定量。

4試劑和材料

除非另有說明，以下所用試劑均為分析純試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。

4.1乙腈（CH3CN）：色譜純。

4.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

4.3甲酸（HCOOH）。

4.4甲酸銨（HCOONH4）。

4.5氨水（NH3?H2O）：濃度≥25%。

4.6氫氧化鈉（NaOH）。

4.7鹽酸（HCL）：濃度≥36%。

4.8氫氧化鈉溶液(2.5mol/L)：準確稱取50g氫氧化鈉，用水定容至500mL，室溫保存。

4.9鹽酸溶液(2.5mol/L)：準確量取104.5mL鹽酸，用水定容至500mL，室溫保存。

4.10甲醇溶液(30%)：量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

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4.11甲醇溶液(20%)：量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均勻，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.12氨水甲醇溶液(0.3%)：吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL，室溫，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4.13脂溶性海洋生物毒素標準（附錄A）溶液：OA、DTX1、DTX2、PTX2、YTX、homo-YTX、AZA1、AZA2、

AZA3、GYM、SPX1標準物質含量≥97%，避光保存于-20℃。

4.14脂溶性海洋生物毒素標準儲備液：分別吸取適量的各脂溶性海洋生物毒素標準溶液（見4.13），

甲醇（見4.2）配制儲備溶液。0.22μm濾膜（見5.12）過濾，-20℃避光保存?zhèn)溆谩８髦苄院Ｑ?/p>

生物毒素標準儲備液濃度分別為：OA40ng/mL,DTX140ng/mL,DTX240ng/mL,YTX400ng/mL,Homo-YTX

400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mL,GYM10ng/mL,AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL,AZA3

100ng/mL。

4.15脂溶性海洋生物毒素混合標準工作溶液：分別吸取適量的各脂溶海洋生物毒素標準儲備溶液（見

4.13），甲醇（見4.2）配制正離子混合標準工作溶液（PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1)）和負

離子混合標準工作溶液（（OA、DTX1、DTX2、YTX、homo-YTX）。0.22μm濾膜（5.12）過濾，-20℃

避光保存?zhèn)溆?。各脂溶性海洋生物毒素的濃度見?。

表1脂溶性海洋生物毒素標準工作溶液（濃度單位：ng/mL）

組別毒素簡稱濃度1濃度2濃度3濃度4濃度5

PTX250025012562.531.25

AZA1100502512.56.26

AZA2502512.56.253.125

正離子

AZA3502512.56.253.125

GYM52.51.250.6250.3125

SPX1100502512.56.26

OA201052.51.25

DTXA201052.51.25

負離子DTX2201052.51.25

YTX200100502512.5

homo-YTX200100502512.5

5儀器設備

5.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。

5.2分析天平：感量0.00001g。

5.3天平：感量0.01g。

5.4勻質機。

5.5渦漩振蕩器。

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5.6離心機。

5.7水浴鍋。

5.8固相萃取裝置。

5.9真空泵。

5.10pH計。

5.11固相萃取柱：基質為含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附劑，填料質量為30mg，體積為1mL，

或者相當。

5.120.22μm濾膜

6樣品

用清水將貝類外表清洗干凈。切開閉殼肌打開貝殼，用蒸餾水淋洗貝類內部以清除泥沙和其他雜物，

取出貝肉置于孔徑約2mm的金屬篩網上瀝水5min。為保證樣品的均勻性，至少取100g貝肉用勻質機勻

漿30min，充分混勻。

7試驗步驟

7.1提取

稱取2.00g貝類組織勻漿于具塞離心管中。加入9.0mL甲醇（見4.2），用渦旋振蕩器混勻1min，3000

rpm離心10min，上清液轉移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇（見4.2）重復提取一次，合并

兩次提取液，用甲醇（見4.2）定容至20mL，將溶液分成兩份，備用。

7.2水解

為了檢測酯化態(tài)的OA組毒素含量。取1.0mL（7.1中的一份）放入色譜進樣瓶中，加入125μL氫氧

化鈉溶液（4.7），用渦旋振蕩器混勻0.5min，置于76℃水浴40min，冷卻至室溫，加入125μL鹽酸

溶液（4.8）中和，渦旋混勻0.5min，過濾（5.12）后備用。

7.3凈化

固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液（7.1中的另一份）加2.8

mL水混勻后轉入預處理的固相萃取柱，以約每秒一滴的流速通過固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液

淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，搖勻后，0.22μm濾膜（4.17）過濾，液相色譜-

串聯(lián)質譜測定。按照7.3步驟凈化水解液。

7.4樣品測定

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7.4.1正離子模式測定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1，液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：C18，50mm×2.1mm，填料粒徑2.5μm，或相當者。

b)流動相：A：2mM甲酸銨和50mM甲酸的水溶液；B：2mM甲酸銨和50mM甲酸的95%乙

腈水溶液。

c)流速：0.3mL/min。

d)柱溫：25℃。

e)進樣量：10μL。

f)流動相梯度：0~4min，10%B線性變化至80%B；4~6min，保持80%B，6~6.5min線性變化

至10%B，平衡2.5min。

7.4.2負離子模式測定OA、DTX1、DTX2和YTX、homo-YTX，液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：C18，150mm×3.0mm，填料粒徑3.5μm，或相當者。

b)流動相：A：0.05%的氨水溶液(pH11)；B：含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10，v/v)溶液(pH11)。

c)流速：0.4mL/min。

d)柱溫：40℃。

e)進樣量：10μL。

g)流動相梯度：1~10min，10%B線性變化至90%B；10~13min，保持90%B，13~15min線性變

化至10%B，平衡4min。

7.4.3質譜條件

a）離子源：電噴霧離子源。

b）掃描模式：正離子和負離子模式。

c）檢測方式：多反應監(jiān)測。

d）噴霧電壓：4500V。

e）毛細管溫度：450℃（正離子模式）；600℃（負離子模式）。

f）源內碰撞解離電壓：5V。

g）霧化氣流速：60L/min。

h）輔助加熱氣流速：50L/min。

i）離子碎片參數(shù)見表2。

表2.離子對、錐孔電壓和碰撞電壓

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目標毒素母離子子離子錐孔電壓V碰撞電壓V

563.2

OA803.5/-80-60

255.1

577.2

DTX1817.5-80-60

255.2

577.2

DTX2803.5-80-60

255.2

1075.5

homo-YTX1155.5-12-45

869.5

1061.7

YTX1141.5-12-48

855.5

823.5

PTX-2876.59039

213.2

824.6

AZA-1842.611046

806.6

838.5

AZA-2856.511046

820.5

810.5

AZA-3828.511046

792.3

490.3

GYM508.49535

392.3

444.2

SPX1692.49040

164.1

7.4.4標準曲線制作

毒素標準系列工作液（見4.13）分別注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，測定相應各毒素的峰面積，以

標準工作液的質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

7.4.5試樣溶液測定

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將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，得到峰面積，根據(jù)基質標注曲線得到試樣溶液中各毒素

的質量濃度。在上述檢測條件下，試樣溶液中各毒素的保留時間與標準溶液中毒素的保留時間之間的偏

差應在±2.5%之內。試樣溶液與標準工作液中毒素的定性離子的相對豐度一致，其豐度比偏差應符合表

3要求。各毒素的特征離子質量色譜圖見附錄B。

表3.定性測定相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度50%20%至≤50%10%至≤20%≤10%

允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%

7.5空白試驗

除不加試樣外，按（7.1，7.2，7.3）步驟得到空白溶液，測定方法同（見7.4）。

8結果計算與表述

8.1結果計算

樣品中各脂溶性海洋生物毒素的含量按公式(1)計算。

(cc)V

Xi0····································(1)

im

式中：

Xi——試樣中脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)/濕重；

ci——從標準工作曲線中得到的試樣中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度(ng/mL)；

c0——從標準工作曲線中得到的空白試驗中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度(ng/mL)；

V——樣品溶液最終定容體積(mL)；

m——最終樣品溶液所代表試樣質量(g)；

以重復性條件下平行測定結果的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)。

8.2總毒力計算

脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附錄C。樣品中脂溶性海洋生物毒素的含量則按照毒性因子，

統(tǒng)一轉換為Wneq來表示，計算公式(2)：n

WeqXr

nii……(2)

i1

Wneq——表示各毒素(OAs、PTXs、AZAs、YTXs)的總毒力；

Xi——表示相對應的脂溶性海洋生物毒素的含量(μg/kg)；

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ri——毒性因子。

9精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。本方法的批內

相對標準偏差≤15%，實驗室間相對標準偏差≤37%。

9.1其他

本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg~200μg/kg添加濃度水平上的回收率為

80%~120%。

表4.脂溶性海洋生物毒素定量限

目標毒素定量限（μg/kg）

OA6.6

DTX19.9

DTX213.2

PTX279.2

YTX85.8

homo-YTX6.6

AZA12.31

AZA23.3

AZA31.65

GYM0.33

SPX13.3

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附錄A

（資料性附錄）

脂溶性海洋生物毒素

毒素簡稱中文名稱英文名稱分子式分子量CASNo.

OA岡田軟海綿酸Okadaicacid(OA)C44H68O13805.0278111-17-8

DTX1鰭藻毒素-1Dinophysistoxin-1C45H70O13819.0381720-10-7

DTX2鰭藻毒素-2Dinophysistoxin-2C44H68O13805.00139933-46-3

PTX-2扇貝毒素-2Pectenotoxin-2C47H70O14859.0797564-91-5

YTX蝦夷扇貝毒素YessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1

homo-YTX類蝦夷扇貝毒素1-HomoyessotoxinC56H84O21S21157.38196309-94-1

AZA-1原多甲藻酸-1Azaspiracid-1C47H71NO12842.1214899-21-5

AZA-2原多甲藻酸-2Azaspiracid-2C48H73NO12856.1265996-92-7

AZA-3原多甲藻酸-3Azaspiracid-3C46H69NO12828.04265996-93-8

GYM環(huán)亞胺毒素GymnodimineC32H45NO4507.71173792-58-0

13-Desmethyl-spirolide

SPX113-去甲螺旋內酯CC42H61NO7691.5334974-07-1

C

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附錄B

（資料性附錄）

特征離子質量色譜圖

負離子和正離子模式下脂溶性海洋生物毒素特征離子色譜圖如圖B.1和圖B.2所示。

圖B.1負離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標準品溶液特征離子質量色譜圖

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圖B.2正離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標準品溶液特征離子質量色譜圖