熱點(diǎn)專題13　PCR技術(shù)及其應(yīng)用

熱點(diǎn)專題13

PCR技術(shù)及其應(yīng)用(本欄目對(duì)應(yīng)學(xué)生用書P312)［熱點(diǎn)歸納］1.概念PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA。2.PCR的原理（1）DNA分子的熱變性原理。當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。溫度緩慢降低到50℃左右時(shí)，兩條彼此分離的DNA鏈重新結(jié)合成雙鏈，這個(gè)過程稱為復(fù)性。DNA雙鏈DNA單鏈（2）耐高溫的DNA聚合酶。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。（3）關(guān)于引物。①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物長(zhǎng)度一般為20~30個(gè)核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸，見下圖：

（4）PCR（體外的DNA復(fù)制）的條件。①控制溫度，但不需解旋酶。②DNA模板。③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，還提供能量。④耐高溫的DNA聚合酶。⑤分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。⑥需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。3.PCR的過程（1）一般情況下，DNA模板鏈較長(zhǎng)，需要PCR擴(kuò)增的基因只是DNA模板鏈的一段。（2）第一輪循環(huán)，兩引物與模板鏈互補(bǔ)，DNA分子模板鏈最長(zhǎng)，新合成的DNA單鏈（含有引物的鏈）較短。（3）第二輪循環(huán)，以含有引物的母鏈為模板合成的DNA分子，會(huì)出現(xiàn)含有引物的DNA，其中新合成的單鏈b會(huì)比母鏈量更短，其實(shí)b就是我們所需擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度，只是b為單鏈。（4）第三輪循環(huán)，以b為模板合成的DNA片段就是目的基因片段的長(zhǎng)度。（5）結(jié)果分析。①兩條單鏈等長(zhǎng)DNA（目的基因）從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)（甲、乙）。隨循環(huán)次數(shù)的增加，目的基因含量會(huì)不斷增加。②通過以上分析可知，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，還會(huì)存在四種類型的DNA分子（這四種類型同第二輪循環(huán)產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子）。③DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，等長(zhǎng)DNA（目的基因）從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，呈指數(shù)擴(kuò)增。4.PCR的應(yīng)用現(xiàn)在PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測(cè)序等?！镜淅咳绻阎恍《蜠NA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖（以EcoRⅠ酶切為例）：請(qǐng)據(jù)圖回答問題。（1）步驟Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于

生物中，限制酶存在于該類生物中的主要作用是

。

（2）步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成

；PCR每次循環(huán)一般可分為

（按順序書寫）三步，其中第二步的目的是

。原核切割外源DNA，保證自身安全磷酸二酯鍵變性、復(fù)性、延伸引物與兩條模板DNA單鏈結(jié)合（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號(hào)）。

項(xiàng)目DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'②5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'③5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'③④（4）對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中（虛線處省略了部分核苷酸序列），結(jié)果正確的是

。

A.5'-AACTATGCG……AGCCCTT-3'B.5'-TTGATACGC……CGAGTAC-3'C.5'-GCAATGCGT……TCGGGAA-3'D.5'-AATTCCATG……CTGAATT-3'D【解析】（1）步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制酶，主要存在于原核生物中，它能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，進(jìn)而在特定部位將雙鏈DNA切開，顯然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保證自身安全。（2）步驟Ⅱ用的是

DNA

連接酶，DNA連接酶催化形成的是磷酸二酯鍵，即催化相鄰核苷酸之間的

3'-羥基與

5'-磷酸間形成磷酸二酯鍵；PCR循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三步，該過程中升溫到95

℃是為了使DNA變性解旋，進(jìn)而獲得DNA單鏈，其中第二步復(fù)性是指引物與兩條模板DNA單鏈結(jié)合，進(jìn)而為后續(xù)的延伸做準(zhǔn)備。（3）由于DNA聚合酶只能從5'→3'方向催化子鏈延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則可知，引物①是以目的基因下邊那條鏈的左端為模板向右側(cè)延伸，引物②是以目的基因上邊那條鏈為模板的右端向左側(cè)延伸，引物③是以目的基因下邊那條鏈的右端為模板向右側(cè)延伸，引物④是以目的基因上邊那條鏈的左端為模板向左側(cè)延伸，本題的目的是要擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，因此，應(yīng)該選擇引物③和④。（4）選項(xiàng)中，A、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要測(cè)定的是未知序列，故選D。解題指導(dǎo)

熟知PCR擴(kuò)增技術(shù)的原理、步驟和相關(guān)的技術(shù)流程是解答本題的關(guān)鍵，正確分析圖示的信息是解答本題的前提，明確題意是解答本題的基礎(chǔ)，掌握堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是解答本題的法寶。［高考試練］1.（2024年四川部分學(xué)校一模）人們所需要的大部分核酸的堿基對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過DNA合成儀可以合成的最長(zhǎng)核酸鏈的堿基對(duì)數(shù)量，而這種大片段基因的人工合成則可以利用重疊延伸PCR的方法（合成過程如圖所示）。據(jù)圖分析回答下列問題。（1）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要設(shè)計(jì)n條單鏈寡核苷酸片段作為引物（如圖中P1~P15），合成這些引物的前提是已知_______

。根據(jù)圖示分析，相鄰近的每2條引物之間均有15~25bp的序列

，若第1輪循環(huán)需要加入引物P6~P9，請(qǐng)?jiān)谙聢D中標(biāo)注出每個(gè)引物的位置。

一段目的基因的核苷酸序列重疊（2）第1輪循環(huán)

（填“需要”或“不需要”）添加模板；第2輪循環(huán)選擇Px和Py分別對(duì)應(yīng)引物

。圖示多輪循環(huán)

（填“能”或“不能”）在同一個(gè)PCR體系中完成，原因是_____________________________

。（3）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因相對(duì)于普通PCR還需要用到

酶；結(jié)合上述內(nèi)容分析利用該技術(shù)合成基因的優(yōu)勢(shì)有______

。

需要P7、P4不能引物之間存在重疊區(qū)域，在同一個(gè)PCR體系中引物之間會(huì)因?yàn)榘l(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而無法完成PCR擴(kuò)增DNA連接可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變、定點(diǎn)敲除【解析】（1）PCR過程中需要有一對(duì)引物，引物設(shè)計(jì)的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列；根據(jù)圖示分析，相鄰近的每2條引物之間均有15~25bp的序列存在重疊區(qū)域；若第1輪循環(huán)需要加入引物P6~P9，結(jié)合圖示可知，

引物的位置可標(biāo)注如下：

。（2）PCR擴(kuò)增時(shí)需要模板，故第一輪循環(huán)也需要加入模板；引物需要與模板的3'端結(jié)合，結(jié)合圖示箭頭方向可知，第2輪循環(huán)選擇Px和Py分別對(duì)應(yīng)引物是P7、P4；由于引物之間存在重疊區(qū)域，在同一個(gè)PCR體系中引物之間會(huì)因?yàn)榘l(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而無法完成PCR擴(kuò)增，故圖示多輪循環(huán)不能在同一個(gè)PCR體系中完成。（3）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因需要連接不同的DNA片段，故相對(duì)于普通PCR還需要用到DNA連接酶；結(jié)合上述內(nèi)容分析利用該技術(shù)合成基因的優(yōu)勢(shì)有可以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變、定點(diǎn)敲除。2.（2025年湖南長(zhǎng)沙階段練習(xí)）豬大腸桿菌會(huì)引起仔豬發(fā)生腸炎、腸毒血癥等疾病。LTB和ST1是豬源大腸桿菌腸毒素基因。研究人員通過重組PCR技術(shù)構(gòu)建了LTB-ST1融合基因，其表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)TB-ST1融合蛋白可有效預(yù)防仔豬黃痢，該融合基因構(gòu)建過程如圖所示。請(qǐng)回答下列問題：（1）重組PCR技術(shù)依據(jù)的生物學(xué)原理是

。（2）PCR1和PCR2是在兩個(gè)不同反應(yīng)體系中進(jìn)行的，兩個(gè)反應(yīng)體系中加入的物質(zhì)中不同的是

。PCR1和PCR2的目的是__________

，從而有利于LTB基因和ST1基因融合。

（3）在②過程中，PCR1和PCR2產(chǎn)物的作用是作為

。DNA的半保留復(fù)制模板、引物擴(kuò)增出末端部分堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的LTB和ST1單鏈模板、引物（4）引物的作用是_______________________________________________

。（5）定點(diǎn)突變是指使基因特定位點(diǎn)發(fā)生堿基對(duì)的增添、缺失或者替換。重組PCR技術(shù)不僅可用于構(gòu)建融合基因，還可用于基因定點(diǎn)突變。請(qǐng)結(jié)合下圖，說明利用重組PCR技術(shù)進(jìn)行基因內(nèi)部定點(diǎn)突變的方法：__________

。

使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸根據(jù)突變位點(diǎn)的堿基序列設(shè)計(jì)引物b和引物c，進(jìn)行重組PCR【解析】（1）PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。（2）PCR1和PCR2是在兩個(gè)不同反應(yīng)體系中進(jìn)行，擴(kuò)增的是兩個(gè)不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同；由圖可知，PCR1和PCR2的目的是擴(kuò)增出末端部分堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的LTB和ST1單鏈，以便于將兩個(gè)基因單鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)接到一起，再以剩下的單鏈部分互為模板擴(kuò)增出LTB—ST1融合基因。（3）PCR1和PCR2的產(chǎn)物是末端部分堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的LTB和ST1單鏈，以便于將兩個(gè)基因連接到一起，所以PCR1和PCR2產(chǎn)物堿基互補(bǔ)序列可起到引物的作用，剩余未互補(bǔ)序列可作為PCR擴(kuò)增的模板。（4）（耐高溫的）DNA聚合酶不能從頭開始將脫氧核苷酸聚合為核