微生物工程 第2章 發(fā)酵菌種選育

第二章微生物工業(yè)的菌種第一節(jié)菌種的分離簡介

一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買從大自然中分離篩選新的微生物菌種二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新菌種分離與篩選的步驟（一）、含微生物材料的選擇

土壤海洋生物體內(nèi)極端環(huán)境和特殊的生態(tài)環(huán)境一般田園土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主;富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多;植物體中富含菌物;海水中富含酵母菌;極端環(huán)境和特殊的生態(tài)環(huán)境:細菌,放線菌和酵母菌從自然界篩選1、采樣季節(jié)：對細菌和放線菌以溫度適中，雨量不多的秋初為好;對菌物在植物生長季節(jié)均適合。2、采樣方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。3、為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。大型菌類盡可能在野外分離（二）、材料的預(yù)處理

熱處理法膜過濾法化學(xué)藥品處理

用0.01N的NaOH處理樣品，可分離得到小單孢菌。用4ml/L的氨水處理后，再用2mg/L的氯處理樣品，分離得到了游動放線菌。（三）選擇性培養(yǎng)

為了容易分離到所需目的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。（四）、分離、篩選方案的設(shè)計

篩選模型加選擇壓力誘餌法、富集培養(yǎng)反應(yīng)特性隨機分離篩選模型

例如:在抗生素的篩選過程中，為避免致病菌的感染與擴散，一般不采用致病菌為試驗的指示菌，盡可能選擇非致病菌而又能代表致病菌的其它微生物作為試驗的指示菌，這些試驗指示菌就稱為篩選模型。誘餌法：在分離樣品或培養(yǎng)基中加入一些特殊的營養(yǎng)物，待菌生長一定時間后，再進行分離。如將涂石蠟的棒置于培養(yǎng)基中，可分離到諾卡氏菌。富集培養(yǎng)：指能增加混合菌群中所需菌株的一種技術(shù)，方法是在混合菌群中提供有利于所需菌株生長或不利于其它微生物生長的條件。反應(yīng)特性：如分離蛋白酶，在不溶性蛋白的平板上可產(chǎn)生一清晰的透明圈，透明圈的大小可作為選擇的依據(jù)。隨機分離：制備一系列培養(yǎng)基，其中各種類型的養(yǎng)分成為限制因子。

避免使用容易同化的碳、氮源，因為它們可能產(chǎn)生分解代謝物阻遏。（五）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法等等。菌種的培養(yǎng)溫度

放線菌：25～30℃嗜熱菌：45～55℃嗜冷菌：4～10℃時間：延長培養(yǎng)時間可以分離到新的或不尋常的菌株

（六）篩選

這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。菌種篩選時應(yīng)考慮的一些重要指標：1、菌的營養(yǎng)特性2、菌的生長溫度3、菌對生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性4、菌種的穩(wěn)定性5、容易從發(fā)酵液中提取產(chǎn)物6、產(chǎn)物的得率高（七）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節(jié)、高產(chǎn)菌株的選育（一）、自然選育（二）、常規(guī)誘變育種（三）、合理誘變育種（四）、原生質(zhì)體融合技術(shù)（五）、基因工程技術(shù)

從自然界直接分離得到的菌種，不能立即適合實際生產(chǎn)的需要，只有通過選育，才能提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，改進品質(zhì)，甚至簡化工藝。（一）、自然選育

不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫做自然選育。評價（二）、常規(guī)誘變育種

利用物理、化學(xué)等誘變劑，使微生物發(fā)生突變而進行菌種選育的過程。評價誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法常規(guī)誘變育種的一般操作過程出發(fā)菌種原種特性考察斜面或搖瓶培養(yǎng)孢子液細胞液誘變劑處理稀釋平板分離以未處理的菌種液為對照，計算致死率；觀察單菌落形態(tài)，統(tǒng)計形態(tài)變異率。選擇、調(diào)取單菌落，轉(zhuǎn)管保存

初篩（以出發(fā)菌種為對照）選出高產(chǎn)突變株，并留種保存

復(fù)篩（以出發(fā)菌種為對照）

根據(jù)情況進行第二、第三…復(fù)篩選出高產(chǎn)突變株，并留種保存選出高產(chǎn)突變株，并留種保存高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性實驗菌種特性考察

小發(fā)酵罐試驗放大實驗、中試考查高產(chǎn)菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗大罐試驗生產(chǎn)誘變育種應(yīng)注意的幾個問題（1）、出發(fā)菌株的選擇（2）、復(fù)合誘變劑的使用（3）、誘變劑的劑量（4）、突變株的篩選（5）、高產(chǎn)突變株培養(yǎng)條件的優(yōu)化常用物理、化學(xué)誘變劑：

（1）、紫外線（2）、快中子（3）、高頻電子流（4）、CO-60（5）、亞硝酸（6）、氮芥（7）、亞硝基胍（三）、合理誘變育種

根據(jù)微生物的代謝調(diào)節(jié)機理來選擇一定類型的微生物突變株，以獲得高產(chǎn)菌株。代謝過程是由酶催化完成的，因此代謝途徑的調(diào)節(jié)也就是酶的調(diào)節(jié)。酶的調(diào)節(jié)分為：酶合成的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)：

誘導(dǎo)：只有在有誘導(dǎo)物存在的時候，酶才能合成，這樣的酶稱為誘導(dǎo)酶。不需誘導(dǎo)物就能合成的酶是組成酶。誘導(dǎo)又分為協(xié)同誘導(dǎo)、順序誘導(dǎo)等。

阻遏:是阻止酶的合成，又有反饋阻遏、分解代謝物阻遏等。酶活性的調(diào)節(jié)：對已經(jīng)存在酶的活性進行調(diào)節(jié)，分為激活和抑制。酶的激活有前體激活、補償性激活等，酶的抑制有終點產(chǎn)物反饋抑制、協(xié)同反饋抑制、累積反饋抑制等。

（1）、選育組成型菌株（2）、選育抗反饋調(diào)節(jié)的突變株（3）、選育營養(yǎng)缺陷型（4）、選育負變菌株的回復(fù)突變株?（5）、選育條件抗性突變株（6）、選育細胞膜透性改變的突變株（7）、選育抗生素抗性突變株（四）、原生質(zhì)體融合技術(shù)

也稱細胞融合技術(shù)，指將一個細胞與另一個細胞融合為一體，使一個細胞的遺傳物質(zhì)（包括核DNA和核外基因）進入另一個細胞。它的目的是：進入一個細胞的另一個細胞的遺傳物質(zhì)為這個細胞所接受，引起這個細胞遺傳特性的改變，并且這種遺傳特性的變異能夠穩(wěn)定遺傳下去。原生質(zhì)體融合簡要說明：金色鏈霉菌，四環(huán)素發(fā)酵單位14000-17000g/ml淡紅鏈霉菌（正定變種1482），柔紅霉素發(fā)酵單位60-80g/ml原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合再生、篩選得到PF-25菌株，柔紅霉素發(fā)酵單位250-300g/ml阿克拉霉素產(chǎn)生菌（鏈霉菌）誘變突變株A不合成阿克拉霉素，但合成阿克拉霉素前體的類似物和2－h(huán)ydroxyaklacinoe突變株B不合成阿克拉霉素，也不合成阿克拉霉素前體的類似物，但能在2－h(huán)ydroxyaklacinoe上接上糖苷原生質(zhì)體融合融合子產(chǎn)生2－羥基阿克拉霉素用原生質(zhì)體技術(shù)提高發(fā)酵單位的例子產(chǎn)物性質(zhì)菌種增產(chǎn)效果西索米星硫鏈絲菌肽碳青霉烯麥迪霉素慶大霉素頭霉素C巴龍霉素種內(nèi)種內(nèi)種內(nèi)種內(nèi)種間屬間種內(nèi)種內(nèi)種間Micromonosporaingoensis運青鏈霉菌灰色鏈霉菌生米卡鏈霉菌生米卡鏈霉菌/灰色鏈霉菌小單孢菌/灰色鏈霉菌小單孢菌Nocardialactamdurans鏈霉菌/弗氏鏈霉菌10－15％2倍10倍40％5倍58％52％15％5－6倍原生質(zhì)體融合技術(shù)的優(yōu)點：（1）、去除細胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換和實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳操作系統(tǒng)（2）、原生質(zhì)體融合后，兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子（3）、重組頻率特別高（4）、可以和其它育種方法相結(jié)合（5）、可以用藥物、溫度、紫外線鈍化親株的一方，然后再進行融合，這樣可以提高篩選的效率（6）、原生質(zhì)體融合并不局限于種內(nèi)，還可以進行種間和屬間的原生質(zhì)體融合（五）、基因工程技術(shù)無論用什么方式獲得的DNA分子，插入到任何載體（包括病毒、細菌的質(zhì)?；蛘呓湍福?，使之形成遺傳物質(zhì)的新組合（即重組DNA分子），再將它們轉(zhuǎn)移到一種原來并不含有這樣新組合的宿主細胞中去，使宿主細胞獲得新的遺傳信息并穩(wěn)定遺傳下去，成為新型生物。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴增與／或表達。基因重組1、基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)及多肽類藥物蛋白質(zhì)及多肽藥物的基因工程是生物工程中最活躍和最有成就的領(lǐng)域。目前應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)的這類藥物已投放市場的有胰島素、干擾素、人生長激素、白介素2、促紅細胞生長素、腫瘤壞死因子、人心鈉素、表皮生長因子等。

人胰島素由A、B二條鏈組成，A是21個氨基酸，B鏈是30個氨基酸，由2個2S鍵相連。3、基因工程在抗生素生產(chǎn)菌種改造方面的應(yīng)用①解除限速步驟，提高抗生素產(chǎn)量

在抗生素合成中，某些步驟對整個生物合成至關(guān)重要，對這些關(guān)鍵步驟酶（限速酶）的改造，可以提高抗生素的產(chǎn)量，如十一烷基靈紅菌素和秦樂菌素生物合成的最后階段的酶是限速酶，該過程是由一個甲基轉(zhuǎn)移酶控制的，將該酶基因克隆后，經(jīng)過適當改造，再轉(zhuǎn)入原菌株阻斷突變株中，使得該酶活性大幅度提高，最終使抗生素的合成能力提高了近10倍。②阻斷支路代謝，增加有效組份含量

阿維菌素B組分向A組分的轉(zhuǎn)化是由aveD基因編碼的C5-O-甲基化酶催化的。AveD③引入抗性基因或調(diào)節(jié)基因，提高抗生素產(chǎn)量大多數(shù)抗生素產(chǎn)生菌都具有對自身產(chǎn)生的抗生素的耐受能力，而抗生素的產(chǎn)量一定程度上取決于對自身產(chǎn)生的抗生素的耐受能力的大小，利用多烤貝質(zhì)粒，克隆這些抗性基因，再轉(zhuǎn)入到產(chǎn)生菌中，從而提高抗生素產(chǎn)生能力。如克隆氨基糖苷δ’-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，再轉(zhuǎn)入卡那霉素和新霉素產(chǎn)生菌中，結(jié)果使菌種自身對氨基糖苷類抗生素的抗性增加，使卡那霉素和新霉素的產(chǎn)量提高了2～6倍。④引入血紅蛋白基因，提高抗生素產(chǎn)量在抗生素發(fā)酵過程中，供氧往往是一個限制因素，且大量消耗能源。在解決供氧方面也有不少成功的報道，美國科學(xué)家將與氧傳遞有關(guān)的透明顫菌的血紅蛋白基因，克隆到天藍色鏈霉菌中，可使在通氣不足時放線紫紅素的產(chǎn)量提高4倍。將血紅蛋白基因克隆倒頭孢菌素C產(chǎn)生菌后，該菌在發(fā)酵過程中氧耗明顯下降，且有效增加了頭孢菌素C的產(chǎn)量。三、菌種退化（一）、退化的原因（二）、防止退化的措施菌種退化：菌種的一個或多個特性，隨時間的推移逐步減退或消失的現(xiàn)象，一般常指菌株的生活力、產(chǎn)孢能力衰退和目的產(chǎn)物產(chǎn)量的下降。（一）、退化的原因1、菌系不純2、異核現(xiàn)象3、自然分化現(xiàn)象4、回復(fù)突變5、培養(yǎng)條件或保藏方法不利6、其它（一）、防止退化的措施1、多做平行菌種，少轉(zhuǎn)接傳代2、認真進行單菌落分離3、選擇有利于高產(chǎn)菌，不利于低產(chǎn)菌的培養(yǎng)條件4、良好的保藏方法四、菌種保藏（一）、菌種保藏的原理（二）、常用菌種保藏的方法（三）、國內(nèi)外重要的菌種保藏機構(gòu)（一）、菌種保藏的原理1、控制培養(yǎng)基營養(yǎng)成份在最低水平2、缺氧3、干燥4、低溫（二）、常用菌種保藏方法1、斜面冰箱保藏法2、砂土管保藏法3、覆蓋惰性液體保藏法4、真空冷凍干燥保藏法5、－30℃低溫保藏法6、液氮超低溫保藏法（三）、國內(nèi)外重要菌種保藏機構(gòu)

1、ATCC：美國模式培養(yǎng)物（菌）保藏中心2、NRRL：美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部3、CSH：美國冷泉港研究所4、IAM：日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所5、IFO：日本發(fā)酵研究所（大阪）6、NCTC：英國國立標準菌種收藏所7、CBS：荷蘭真菌中心保藏所

8、中國普通微生物菌種保藏管理中心

中國科學(xué)院微生物研究所（真菌、細菌），北京中國科學(xué)院武漢病毒研究所（病毒），武漢9、中國典型微生物菌種保藏管理中心武漢大學(xué)，武漢10、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京11、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所（真菌），南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所（細菌），北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所（病毒），北京12、工業(yè)微生物菌種保藏管理中心輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所，北京一、自然界中細菌的分離第三節(jié)幾種微生物培養(yǎng)分離

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長1．土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。2．植物體采集方法在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。

3．水樣采集方法用于細菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。土中細菌的富集培養(yǎng)與分離

分離土樣中的大部分細菌的分離程序中無需進行富集。但對某些少數(shù)細菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。富集方法運用細菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。土樣中細菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細菌的分離：水樣通過0.22μm無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。水中細菌分離的簡易富集技術(shù)在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌、中溫菌和嗜高溫菌。次代培養(yǎng)及純化步驟1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。4、將認為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選。二、放線菌的分離(一)采樣及采集方法應(yīng)盡可能實行無菌操作。所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。樣本采集完后，應(yīng)及時處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時間不宜過長。放線菌的分離(實驗已經(jīng)進行)土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或