L-α-甘磷酸膽堿審查細(xì)則附件

L-α-甘磷酸膽堿L-α-甘磷酸膽堿英文名稱L-alpha-Glycerylphosphorylcholine基本信息結(jié)構(gòu)式：CAS號(hào)：28319-77-9分子式：C8H20NO6P相對(duì)分子質(zhì)量：257.22以多聚磷酸、氯化膽堿、R-3-氯-1,2-丙二醇、氫氧化鈉和水為原料，經(jīng)縮合和酯化反應(yīng)后，再經(jīng)脫色、除雜、濃縮、精制、干燥等工藝制推薦食用量≤600毫克/天（以干基計(jì)）其他需要說說明書應(yīng)當(dāng)標(biāo)注不適宜人群和食用限量。2.質(zhì)量規(guī)格和食品安全指標(biāo)見附錄。感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。檢測(cè)方法光線下，觀察其色澤和狀具有甜味無異嗅味結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，有吸濕性2.理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。檢測(cè)方法L-α-甘磷酸膽堿(以干基計(jì))，g/100g98.0-102.0pH值5.0-7.0GB5009.237GB5009.3GB5413.20β-甘磷酸膽堿，g/100g不得檢出0.05氯化物(以Cl計(jì))，g/100g≤0.02《中華人民共和國(guó)藥化物檢查法”磷酸鹽，mg/kg≤GB5009.256L-α-甘磷酸膽堿測(cè)定方法滴定法A.1原理基于高氯酸與L-α-甘磷酸膽堿的三甲胺基團(tuán)發(fā)生酸堿反應(yīng)，形成中和物質(zhì)L-α-甘磷酸膽堿-高氯酸鹽，采用電位滴定法，通過突躍點(diǎn)判定滴定終點(diǎn)。A.2試劑和溶液A.2.1乙酸，分析純。A.2.2乙酸酐，分析純。A.2.3高氯酸，分析純。A.2.4鄰苯二甲酸氫鉀，基準(zhǔn)級(jí)。A.2.50.1mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：取乙酸750mL，加入高氯酸8.5mL，搖勻。在室溫下緩緩滴加乙酸酐23mL，邊加邊搖，加完后再振搖均勻，放冷，加乙酸至1000mL，搖勻，放置24小時(shí)，即得。A.3儀器和設(shè)備A.3.1電位滴定儀：配玻璃電極。A.3.2分析天平：感量0.01mg或0.1mg。A.4分析步驟A.4.1標(biāo)定A.4.1.10.1mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液標(biāo)定：準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的基準(zhǔn)級(jí)鄰苯二甲酸氫鉀0.16g（精確到0.01mg加乙酸60mL溶解。用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行電位滴定，通過突躍點(diǎn)判定滴定終點(diǎn)，并將滴定的結(jié)果用空白試A.4.1.2高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液計(jì)算c—高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定濃度，單位為摩爾每升（mol/LW—基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀的稱取量，單位為克（gV—標(biāo)定中消耗0.1mol/L高氯酸溶液的體積，單位為毫升（mLV0—標(biāo)定中空白試驗(yàn)消耗0.1mol/L高氯酸溶液的體積，單位為毫升（mLM—鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol）[M(KHC8H4O4)=204.22]；1000—體積單位換算系數(shù)。A.4.2樣品檢測(cè)稱取待測(cè)試樣約0.2g（精確到0.01mg分別加入20mL乙酸與40mL乙酸酐溶解，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行電位滴定，通過突躍點(diǎn)判定滴定終點(diǎn)，記錄試樣所消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。A.4.3空白試驗(yàn)取20mL乙酸與40mL乙酸酐，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行電位滴定，通過突躍點(diǎn)判定滴定終點(diǎn)，記錄空白試驗(yàn)所消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。A.5結(jié)果計(jì)算試樣中L-α-甘磷酸膽堿含量按式（2）計(jì)算：式中：百克（g/100gc—高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定濃度，單位為摩爾每升（mol/L的體積，單位為毫升（mL的體積，單位為毫升（mLM—L-α-甘磷酸膽堿的摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol）[M(C8H20NO6P)=257.22]；m—待測(cè)試樣的質(zhì)量，單位為克（gw—試樣中的水分含量，單位為克每百克（g/100g100—試樣中量以每100克計(jì)算的換算系數(shù);1000—體積單位換算系數(shù)。A.6精確度試驗(yàn)結(jié)果以兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為準(zhǔn)。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的0.5%。β-甘磷酸膽堿測(cè)定方法液相色譜法件下分離，使用蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，以絲氨酸（與L-α-甘磷酸膽堿校正因子一致）為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。B.2試劑和溶液B.2.1絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：56-45-1純度≥99%。B.2.2β-甘磷酸膽堿（CAS號(hào)：18418-25-2），本品為定性標(biāo)準(zhǔn)品，用于定性分析。B.2.3乙腈，色譜純。B.2.4甲酸銨，色譜純。B.2.5甲酸，色譜純。B.2.6水（符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水）。B.2.7稀釋液，乙腈:水=1:1（v:v）。B.2.8甲酸鹽緩沖液配制：稱取甲酸銨6.35g于1000mL容量瓶中，加水適量溶解后加甲酸5mL，加水定容至刻度，搖勻備用。B.3儀器和設(shè)備B.3.1高效液相色譜儀：配備蒸發(fā)光檢測(cè)器。B.3.2電子天平：感量0.01mg或0.1mg。B.4分析步驟B.4.1參考色譜條件b)流速：0.7mL/min；c)柱溫：30℃;e)進(jìn)樣量：30μL；f)流動(dòng)相：乙腈:甲酸鹽緩沖液=78:22（v:v），等度洗B.4.2空白溶液制備取稀釋液作為空白溶液。B.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備解并稀釋至刻度，得1.0mg/mL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取上述儲(chǔ)備液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL和6.0mL，分別置50mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻和120μg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。B.4.4β-甘磷酸膽堿定性溶液制備稱取β-甘磷酸膽堿約2.50mg于5mL容量瓶中，加稀釋液使溶解，定容，作為β-甘磷酸膽堿儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取上述儲(chǔ)備液2.0mL于10mL容量瓶中，加稀釋液定容至刻度，搖勻，備用。B.4.5試樣溶液制備稱取試樣0.2g（精確到0.01mg）于10mL容量瓶中，加稀釋液溶解并定容至刻度，搖勻備用。B.5測(cè)定B.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在規(guī)定的色譜條件下取絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各30μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析，記錄所得各標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中絲氨酸的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的對(duì)數(shù)為X軸，以進(jìn)樣質(zhì)量（單位為微克(μg對(duì)數(shù)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為a，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距為b。B.5.2試樣溶液的測(cè)定在規(guī)定的色譜條件下取空白溶液、β-甘磷酸膽堿定性溶液和試樣溶液各30μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析，記錄試樣溶液色譜圖中β-甘磷酸膽堿的峰面積。B.6計(jì)算試樣中的β-甘磷酸膽堿的含量按式（1）計(jì)算：式中：（g/100ga—絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；A—測(cè)得試樣溶液中β-甘磷酸膽堿的峰面積；V—試樣溶液制備時(shí)的定容體積，單位為毫升（mLv—進(jìn)樣量，單位為微升(μLm—待測(cè)試樣的稱樣量，單位為克（g100—試樣中量以每100克計(jì)算的換算系數(shù);1000—質(zhì)量單位換算系數(shù)。B.7精確度試驗(yàn)結(jié)果以兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為準(zhǔn)。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的20%。B.8檢出限和定量限當(dāng)取樣量為0.2g時(shí)，本方法檢出限為0.025g/100g，定量限為0.05g/100g。B.9液相色譜圖圖B.1絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖B.2β-甘磷酸膽堿的定性色譜圖圖B.3L-α-甘磷酸膽堿試樣測(cè)定色譜圖D-α-甘磷酸膽堿測(cè)定方法液相色譜法L-α-甘磷酸膽堿和D-α-甘磷酸膽堿通過手性硅膠色譜柱分離，使用高效液相色譜蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，以L-α-甘磷酸膽堿（與D-α-甘磷酸膽堿校正因子一致）為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。C.2試劑和溶液C.2.1L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：28319-77-9），純度C.2.2D-α-甘磷酸膽堿（CAS號(hào)：4217-84-9），本品為定性標(biāo)準(zhǔn)品，用于定性分析。C.2.3水，GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。C.2.4無水乙醇，色譜純。C.2.5異丙醇，色譜純。C.2.6甲醇，色譜純。C.2.7正己烷，色譜純。C.2.8二乙胺，分析純。C.2.9稀釋液，無水乙醇:異丙醇:甲醇=90:5:5（v:v:v），色C.3儀器和設(shè)備C.3.1高效液相色譜儀：配備蒸發(fā)光檢測(cè)器。C.3.2電子天平：感量0.01mg或0.1mg。C.4分析步驟C.4.1參考色譜條件表面共價(jià)鍵合型；b)柱溫：25℃;c)流速：0.7mL/min；d)進(jìn)樣量：30μL；e)流動(dòng)相：以正己烷:稀釋液:二乙胺=68:32:0.1（v:v:v等度洗脫。C.4.2空白溶液制備取稀釋液作為空白溶液。C.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備準(zhǔn)確稱取L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)品25mg于100mL容量瓶中，加稀釋液適量超聲使溶解，定容，搖勻，得到0.25mg/mLL-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL和2.4mLL-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，作為制作L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。C.4.4D-α-甘磷酸膽堿定性溶液制備稱取D-α-甘磷酸膽堿3.125mg于25mL容量瓶中，加稀釋液超聲使溶解，定容，作為D-α-甘磷酸膽堿儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取上述儲(chǔ)備液1.5mL于50mL容量瓶中，加稀釋液定容至刻度，搖勻備用。C.4.5試樣溶液制備準(zhǔn)確稱取L-α-甘磷酸膽堿試樣75.00mg于10mL容量瓶中，加稀釋液適量超聲使其溶解，取出放至室溫，定容，搖勻，過濾后備用。C.5測(cè)定C.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在規(guī)定的色譜條件下取各L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用溶液30μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中位為微克(μg對(duì)數(shù)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為a，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距為b。C.5.2試樣溶液的測(cè)定在規(guī)定的色譜條件下取空白溶液、D-α-甘磷酸膽堿定性溶液和試樣溶液各30μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析。以D-α-甘磷酸膽堿定性溶液中D-α-甘磷酸膽堿保留時(shí)間定性，并記錄試樣溶液色譜圖中D-α-甘磷酸膽堿的峰面積。C.6計(jì)算試樣中D-α-甘磷酸膽堿的含量按式（1）計(jì)算：w—試樣中D-α-甘磷酸膽堿含量，單位為克每百克（g/100ga—L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—L-α-甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；A—測(cè)得試樣溶液中D-α-甘磷酸膽堿的峰面積；V—試樣溶液制備時(shí)的定容體積，單位為毫升