DB34T 4878-2024包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法

34RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater—Colloidalgoldimmunochromatographicass.I本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。1包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測(cè)膠體金免疫層析法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB8538食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉樣品中的銅綠假單胞菌經(jīng)濾膜過濾富集，超聲處理提取DNA，以此為模板，設(shè)計(jì)經(jīng)異硫（FITC）和生物素（biotin）修飾的上下游引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）得到擴(kuò)增導(dǎo)致T線顏色加深，通過T線與控制線（C線）顏色比較，銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：CMCC（B）10282或等效25.9TE緩沖溶液：量取1mLTris-HCl溶液(5.7)于100mL容量瓶中，再加入0.2mLEDTA(5.8)溶液，加水(5.1)定容至100mL。4℃保存，有效期一年。5.12上樣緩沖液：主要成分為Tris-HC1溶液、檸檬酸鈉緩沖液、吐溫20、聚乙二醇20000。5.13營(yíng)養(yǎng)肉湯：主要成分為蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、葡萄糖。5.14銅綠假單胞菌菌懸液：用接種環(huán)挑取平皿上培養(yǎng)20h~24h的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(5.2)典型菌落，接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯(5.13)中，37℃±1℃培養(yǎng)18h~20h,至活菌數(shù)達(dá)到1×108CFU/mL~5×108CFU/mL時(shí)，即制得銅綠假單胞菌菌懸液。5’-FITC-ACCGCCGTCAGAA6.1PCR儀。6.6電子天平：感量分別為0.01g和0.001g。6.9離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速≥5000rpm。6.10pH計(jì)。6.12膠體金讀卡儀(可選)。7檢測(cè)將250mL待檢水樣通過孔徑0.45μm的無菌濾膜(6.7)過濾，濾膜備用。以無菌水作為空白對(duì)照，以銅綠假單胞菌菌懸液(5.14)作為陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照。將7.1得到的濾膜置于無菌瓶底部，加入1mL的TE緩沖溶液(5.9)重懸，超聲后將瓶中溶液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，5000rpm室溫離心5min,取上清液備用。7.3PCR擴(kuò)增取7.2得到的上清液2μL,加入PCR預(yù)混液(5.10)12.5μL,10μmol/L上下游引物(5.15)各0.8μL,ddH?O(5.11)8.9μL61℃退火30s,72℃延伸30s,共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2min,得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用。3取7.3得到的擴(kuò)增產(chǎn)物2μL,滴加在膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條(6.11)上，再滴加48μL上樣緩沖液(5.12)于樣品墊上，靜置3min,觀察T線和C線顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定?？刂凭€(C線)不顯色，或空白試驗(yàn)檢測(cè)線(T線)顯色，或陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn)檢測(cè)線(T線)不顯色，均判定無效。示意圖見圖1。控制線(C線)顯色，檢測(cè)線(T線)不顯色?？刂凭€(C線)與檢測(cè)線(T線)均顯色。LT線L陰性陽(yáng)性無效空白無效質(zhì)控?zé)o效圖1目視判定示意圖檢出限為1CFU/250mL。45N12N21N22N2.=N21+N22N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2）2=（|N12-N21