DB62T 2689-2022 犢牛腹瀉病防治技術(shù)規(guī)范

犢牛腹瀉病防治技術(shù)規(guī)范2022-07-31實施2022-07-31實施I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替DB62/T2689—2016《犢牛腹瀉病防治技術(shù)規(guī)范》,與DB62/T2689—2016《犢牛腹瀉病防治技術(shù)規(guī)范》相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：a)更改了規(guī)范性引用文件；b)更改了術(shù)語和定義；c)完善了對牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌、隱孢子蟲引起的犢牛腹瀉病等疫病的定義、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化和防治技術(shù)等內(nèi)容；d)完善了“預(yù)防”一章，包括飼養(yǎng)管理、消毒、免疫接種、無害化處理4條內(nèi)容；f)增加了牛冠狀病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作方法、大腸桿菌培養(yǎng)、犢牛隱孢子蟲卵囊分離鑒定方法3個規(guī)范性附錄。本文件由甘肅省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實施。本文件由甘肅省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心、岷縣麻子川鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站、莊浪縣良邑鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站、甘南州動物疫病預(yù)防控制中心、華池縣城壕鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心、合作市動物疫病預(yù)防控制中心、臨潭縣冶力關(guān)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站、臨潭縣羊沙鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站、永登縣樹屏鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心、華池縣山莊鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心。本文件主要起草人：張小寧、劉劍鵬、文立波、肖敏、劉世杰、李改紅、李小玲、李勇生、索明艷、賈麗娜、洪海鳳、楊玉斌、李萬志、趙朝霞、楊歡。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為： 2016年首次發(fā)布為DB62/T2689—2016;——本次為第一次修訂。本文件由甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)解釋。各單位或個人在執(zhí)行本文件過程中如發(fā)現(xiàn)需要修改和補充之處，請隨時將意見和建議反饋至《犢牛腹瀉病防治技術(shù)規(guī)范》地方標(biāo)準(zhǔn)編制組(地址：甘肅省蘭州市城關(guān)區(qū)紅柳灘路41號，郵編：730046,聯(lián)系人：張小寧，E-mail:497756430@,聯(lián)系方式,以供今后修訂時參考。1本文件適用于牛輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB/T35942隱孢子蟲套式PCR檢測方法GB/T36195畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范⑩FNY/T1167⑩FNY/T1949隱孢子蟲卵囊檢測技術(shù)改良抗酸染色法NY5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)NY/T5030無公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則NY5032無公害食品畜禽飼料和飼料添加劑使用準(zhǔn)則NY/T5128無公害食品肉牛飼養(yǎng)管理準(zhǔn)則2犢牛大腸桿菌病bovinecolibacillosis又名大腸桿菌性腹瀉、犢牛白痢，由致病性大腸桿菌引起犢牛腸炎、腸毒血癥、腹瀉、脫水為主要癥狀的傳染病。牛隱孢子蟲病bovinecryptosporidiosis由隱孢子蟲寄生于犢牛腸道進而引起以腹瀉為主要癥狀的一種原蟲病。4流行病學(xué)4.1傳染源患病動物、隱性感染者或攜帶隱孢子蟲的動物為主要傳染源。4.2易感動物3周齡以內(nèi)的犢牛最易感。4.3傳播途徑病原隨糞便、尿液、口腔、鼻腔等分泌物排出體外，主要通過污染的飼料、飲水等經(jīng)消化道傳播。4.4流行特點一年四季均可發(fā)生，冬春季節(jié)多發(fā)。5臨床癥狀5.1牛輪狀病毒病潛伏期18h～96h,多發(fā)生于7日齡以內(nèi)的犢牛。病初精神沉郁，食欲減退，排出黃白色或乳白色黏稠糞便；之后腹瀉明顯，排出大量黃白色或灰白色水樣稀便；嚴(yán)重時脫水明顯，最后因心力衰竭、代謝性酸中毒，體溫下降，最終死亡。5.2牛冠狀病毒病急性型，多發(fā)于7日齡～10日齡的犢牛，潛伏期為1d～2d,精神沉郁，食欲減退，持續(xù)腹瀉；感染48h后出現(xiàn)黃色或黃綠色稀便，并持續(xù)3d～6d,后期糞便中帶有腸黏膜和血液，嚴(yán)重者排水樣便，重癥者在7d內(nèi)因急性脫水和代謝性酸中毒衰竭死亡；慢性型，2周齡～6周齡犢牛多見，常表現(xiàn)為持續(xù)性或間歇性腹瀉，有腹痛表現(xiàn)。5.3大腸桿菌病敗血型多發(fā)于6日齡以內(nèi)的犢牛，呈急性敗血病癥狀；病初體溫升高，精神沉郁，食欲減退，腹瀉，常于癥狀出現(xiàn)后數(shù)小時至1d內(nèi)病犢急性敗血癥死亡。腸毒血癥型多發(fā)于7日齡以內(nèi)犢牛，急性無明顯癥狀突然死亡。腸炎型多發(fā)于7日齡～10日齡的犢牛，病初體溫升高，糞便初如粥樣、黃色，后呈水樣、灰白色，混有未消化的凝乳塊、凝血及泡沫。5.4隱孢子蟲病36.2冠狀病毒病真胃有大量凝乳塊，黏膜充血、出血、水腫；腸內(nèi)容物混有血7.1.1符合5.1、6.1可初步診斷為犢牛輪狀病毒性腹瀉。7.1.2符合5.2、6.2可初步診斷為犢牛冠狀病毒性腹瀉。7.1.3符合5.3、6.3可初步診斷為犢牛大腸桿菌性腹瀉。7.1.4符合5.4、6.4可初步診斷為犢牛隱7.2.1符合7.1.1,且符合實驗室診斷結(jié)果(按照附錄A執(zhí)行),可確診為犢牛輪狀病毒性腹瀉。7.2.2符合7.1.2,且符合實驗室診斷結(jié)果(按照附錄B執(zhí)行),可確診為犢牛冠狀病毒性腹瀉。7.2.3符合7.1.3,且符合實驗室診斷結(jié)果(按照附錄C執(zhí)行),可確診為犢牛大腸桿菌性腹瀉。7.2.4符合7.1.4,且符合實驗室診斷結(jié)果(按照附錄D執(zhí)行),可確診為犢牛隱孢子蟲感染引起的腹8.1.2飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)符合GB13078,飲水要求按照NY5027的規(guī)定執(zhí)行。8.1.3環(huán)境控制應(yīng)符合NY/T388、NY/T1167的規(guī)定。48.2.1消毒技術(shù)按照NY/T3075規(guī)定進行，消毒藥的選擇和8.2.2嚴(yán)格控制人員、車輛、相關(guān)物品出入，嚴(yán)8.2.4對哺乳母牛乳頭徹底清洗干凈、消毒。哺乳壺、桶、奶嘴、毛巾等哺乳用具用后要嚴(yán)格煮沸消毒，晾干，用前用85℃以上熱水或蒸汽消毒。8.2.5養(yǎng)殖場糞污處理嚴(yán)格按照GB/T36195的規(guī)定執(zhí)行。9治療9.1獸藥使用應(yīng)符合NY/T5030的規(guī)定。9.2針對輪狀病毒和冠狀病毒引起的腹瀉，及時隔離，防止繼發(fā)感染；針對酸中毒，靜脈注射5%碳酸氫鈉注射液，每次100mL～200mL,或1.9%乳酸鈉溶液500mL～1000mL。9.3對持續(xù)腹瀉不止的犢牛，可應(yīng)用明礬、次硝酸鉍、硅酸銀、顛茄酊(或流浸膏),內(nèi)服。9.4因隱孢子蟲引起的腹瀉，磺胺類藥物或氨丙嘧啶有一定效果。氯氨滅球靈、氨丙啉和氯甲羥吡啶9.5及時補充體液，若脫水僅占體重8%以下時，給予口服補液；若脫水占體重9.6制止腸內(nèi)腐敗、發(fā)酵過程，除應(yīng)用抗生素和磺胺類藥外，也5(規(guī)范性)牛輪狀病毒病原學(xué)檢測方法A.1樣品采集樣品采集按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。采集的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h;如需長期保存，應(yīng)放置-20℃下保存，避免反復(fù)凍融。A.2樣品處理A.2.1糞便樣品孔針頭濾器過濾除菌待檢。A.2.2組織及內(nèi)容物樣品取小腸和腸內(nèi)容物0.2g,用含有100IU青霉素和100μg鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液浸泡沖洗兩次，然后剪碎裝進研磨器內(nèi)，在研磨器內(nèi)加入2mL無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，研磨成糊狀，制成10%組織懸液，10000r/min、4℃離心15min,吸取上清液，用0.22μm微孔針頭濾器過濾除菌待檢。A.3牛輪狀病毒微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法提取待檢樣品的病毒RNA,進行微滴化處理，微滴生成后，在PCR擴增儀上進行微滴式數(shù)字RT-PCR擴增。A.4結(jié)果判定樣品中牛輪狀病毒基因未得到擴增，擴增終點熒光信號低于閾值，判定為陰性。樣品中牛輪狀病毒基因得到擴增，擴增終點熒光信號高于閾值，判定為陽性。6(規(guī)范性)牛冠狀病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作方法B.1檢測樣本血清、血漿、細(xì)胞上清液、組織勻漿、尿液、胸腹水、腦脊液，樣本如不能及時檢測應(yīng)-20℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融。B.2實驗原理及類型將己知抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進行定性或或定量測定。ELISA可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原。B.3樣本處理及要求全血標(biāo)本于室溫放置2h或4℃過夜后于1000g離心20min,取上清液即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。B.3.2血漿可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集30min內(nèi)于2℃~8℃1000g離心20min,或?qū)?biāo)本置于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。B.3.3細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本1000g離心20min,取上清液即可檢測，或?qū)?biāo)本置于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。B.4操作步驟B.4.1從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。B.4.2設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。B.4.3樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。B.4.4除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min。B.4.5棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,用去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。B.4.6每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。B.4.7每孔加入終止液50μL,15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。7(規(guī)范性)大腸桿菌鑒定C.1菌種凍存液的制備含有足量細(xì)菌的液體培養(yǎng)基離心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80℃凍存。C.2培養(yǎng)基制備LB培養(yǎng)基配方(胰化蛋白胨：10g/L;酵母提取物：5gL;NaCI:10g/L;pH7.4)液體培養(yǎng)基胰化蛋白胨酵母粉氯化鈉水pH固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加入1.5%～2.0%的瓊脂C.3平板的制備C.3.1稱取胰化蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl10.0g,加入800mL水溶解，并用玻璃棒攪拌均勻，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.4左右，定容至1L,調(diào)pH7.4(若溶液pH大于7.4,用1mol/LHCl回調(diào))。C.3.2分裝在錐形瓶中，每瓶量不宜太多，沒過瓶底一指左右。如需固體培養(yǎng)基在分裝后的液體培養(yǎng)基內(nèi)加入約2%的瓊脂(150mL液體培養(yǎng)基加入2.5g瓊脂)。C.3.3在錐形瓶口依次蓋帶濾紙通氣小孔的塑料膜和硬質(zhì)紙，用皮筋捆好。所有錐形瓶如上述操作。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。C.3.4高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌15min。C.3.5滅菌后的培養(yǎng)基取出置電熱鼓風(fēng)干燥器內(nèi)60℃烘干，待錐形瓶的封口紙干燥后取出。液體培養(yǎng)基可直接保存或使用，此時加有瓊脂的培養(yǎng)基不會凝固，可在預(yù)先紫外殺菌30min以上的無菌操作臺上，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿培養(yǎng)基約10mL～15mL(直徑90mm),在培養(yǎng)皿中厚度大約4mm左右。將平皿疊放在無菌操作臺上，放置10min左右，待瓊脂基本凝固可涂平板。C.3.6若平板不直接使用，滅菌后將培養(yǎng)基在錐形瓶中保存，待需制備平板時，微波爐中火加熱約3min,使瓊脂熔化，室溫冷卻20min至不燙手可制備平板。C.4接種大腸桿菌C.4.1取儲備的大腸桿菌BL21凍存液，管口用酒精燈灼燒，打開離心管。C.4.2接種方法一：用滅菌槍頭蘸取凍存液在平板邊緣上劃橫條，每三道為一組，旋轉(zhuǎn)平皿一圈，最后中間劃之字；接種方法二：用移液槍吸取100μL溶液于平板上，用酒精燈滅菌后的涂抹棒劃十字，涂布平板。8C.4.3涂平板時應(yīng)考慮凍存液內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，若菌量過大應(yīng)適當(dāng)稀釋。一般方法獲得單菌落的可能性比較大。涂平板應(yīng)在酒精燈附近進行，若凍存液涂完的平板應(yīng)倒置，防止平皿蓋上產(chǎn)生水蒸氣。C.5大腸桿菌的培養(yǎng)C.5.1將接種好的平皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約十幾小時后長出菌落。C.5.2挑取生長狀態(tài)好，特征明顯的單個菌落，接種于新鮮滅菌的LB液體培養(yǎng)基中37℃,220rpm/min恒溫振蕩培養(yǎng)9h～12h。菌落特征：乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。9(規(guī)范性)犢牛隱孢子蟲卵囊分離鑒定D.1隱孢子蟲卵囊的提取用一次性手套采集2周齡～4周齡的犢牛新鮮糞便，置于同體積5%的K?Cr?O?中，4℃保存待檢。用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法提取隱孢子蟲卵囊，提取的卵囊置于2.5%K?Cr?O?溶液中，4℃保存?zhèn)溆?。D.2涂片鏡檢用膠頭滴管吸取經(jīng)上述方法初步純化的卵囊液，3000r/min,離心15min,沉淀用PBS洗2次除去K?Cr?O?,卵囊懸于PBS。吸取適量稀釋好的卵囊液，滴于載玻片上并加蓋蓋玻片，立即在400倍顯微鏡下測量其大小和1000倍油鏡下觀察卵囊形態(tài)。D.3單克隆抗體檢測隱孢子蟲卵囊采用間接免疫熒光試驗檢測隱孢子蟲卵囊，吸取經(jīng)上述方法制備的卵囊液，滴于干凈的載玻片上，自然涼干，用蠟筆在樣品周圍畫圈，火焰固定；滴加抗小隱孢子蟲卵囊單克隆抗體約25μL于載玻片的樣品上，37℃孵育30min;0.01MpH7.4PBS緩沖液洗3次；滴加按要求稀釋的異硫氫酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠抗體于樣品上，37℃孵育30min;0.01MpH7.4PBS緩沖液再洗3次；磷酸甘油緩沖液封片，400倍熒光顯微鏡下觀察。D.4小鼠感染試驗實驗小鼠5只，體重12g~14g,4周齡，雌性。實驗前徹