申報書-超表達黃花苜蓿LEA-like基因提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性和產(chǎn)量

序號：編碼：“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽決賽作品申報書作品名稱：超表達黃花苜蓿LEAlike基因提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性和產(chǎn)量學(xué)院名稱：生命科學(xué)學(xué)院申報者姓名（集體名稱）：卓春柳類別：eq\o\ac(□,√)自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

說明1.申報者應(yīng)在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3.表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復(fù)制。4.序號、編碼由競賽組委會填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字數(shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。A1．申報者情況（個人項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內(nèi)必須填寫個人作品的第一作者（承擔(dān)申報作品60%以上的工作者）；2．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認。姓名卓春柳性別女出生年月1987年2月申報者情況學(xué)院全稱生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)生物科學(xué)現(xiàn)學(xué)歷本科年級05級學(xué)制4年入學(xué)時間2005年9月作品全稱超表達黃花苜蓿LEAlike基因提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性和產(chǎn)量畢業(yè)論文題目黃花苜蓿CAB基因的克隆、表達分析及表達載體構(gòu)建通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院05級生物科學(xué)3班郵政編碼510642單位電話02085280185常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)躍進南學(xué)生宿舍區(qū)36棟106室郵政編碼510642住宅電話02038794303合作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位無資格認定學(xué)院學(xué)籍管理部門意見是否為2009eq\o\ac(□,√)是□否若是，其學(xué)號為：200530710331（部門蓋章）年月日院系負責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實踐活動成果eq\o\ac(□,√)是□否負責(zé)人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認；3．作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路目的：從冷處理黃花苜蓿葉片cDNA中篩選出MfLEAlike，轉(zhuǎn)化模式植物中煙90，并對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進行抗逆性分析，以篩選出性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因煙草。通過對MfLEAlike基因功能進行初步研究，為利用該抗性基因改造其他經(jīng)濟作物提供有益的探索?；舅悸罚焊鶕?jù)本實驗室龐朝樞構(gòu)建的“黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因縮減雜交文庫”，從中篩選出MfLEAlike的主體片段，克隆出基因編碼區(qū)全長。利用半定量RTPCR技術(shù)，分析該基因在低溫脅迫下的表達規(guī)律。本研究還構(gòu)建了pBIMfLEAlike超表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進行抗逆性及生長狀況分析。生物信息學(xué)分MfLEAlike基因的克隆低溫脅迫對MfLEAlike表達模式的影響序列分析植物表達載體的構(gòu)建進化樹構(gòu)建轉(zhuǎn)化模式植物煙草蛋白定位預(yù)測轉(zhuǎn)基因煙草分子檢測鑒定PCR檢測，Southern雜交分析獲單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，收種提高抗寒性提高抗寒性促進生長提高抗寒性T1代轉(zhuǎn)基因煙草提高抗寒性提高抗寒性促進生長提高抗寒性抗逆性分析生長狀況分析作品的科學(xué)性、先進性及獨特之處科學(xué)性：研究目的明確，實驗設(shè)計合理，可操作性強。從黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因縮減雜交文庫中篩選出MfLEAlike的主體片段，克隆出基因編碼區(qū)全長，并進行生物信息學(xué)分析以及分析該基因在低溫脅迫下的表達規(guī)律，推斷該基因在植物抗寒中具有重要作用。構(gòu)建超表達載體，轉(zhuǎn)化模式植物中煙90，并對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進行抗逆性及生長狀況分析，以篩選出性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因煙草。通過對MfLEAlike基因功能進行初步研究，為利用該抗性基因改造其他經(jīng)濟作物提供有益的探索。先進性：應(yīng)用了先進的生物技術(shù)和創(chuàng)新的分析方法。獨特之處：LEA蛋白在植物抗逆性調(diào)節(jié)、基因工程抗性育種等方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景，黃花苜蓿冷響應(yīng)基因的相關(guān)研究和利用處于起步階段，有關(guān)黃花苜蓿LEA家族蛋白的研究尚未有報道。本研究中超表達黃花苜蓿LEAlike基因提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性和產(chǎn)量，為深入研究該冷誘導(dǎo)基因的功能，進行作物抗逆性基因工程育種打下基礎(chǔ)，為利用該抗性基因改造其他經(jīng)濟作物提供有益的探索。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義干旱、鹽漬及低溫是制約植物生長、降低其產(chǎn)量的三大非生物因素。其中，低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍，同時還會造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴重時甚至絕收。全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達數(shù)千億元（DENGJM等，2001）。本研究中超表達黃花苜蓿LEAlike基因提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性和產(chǎn)量，為深入研究該冷誘導(dǎo)基因的功能，進行作物抗逆性基因工程育種打下基礎(chǔ)，為利用該抗性基因改造其他經(jīng)濟作物提供有益的探索。學(xué)術(shù)論文文摘摘要：黃花苜蓿（MedicagofalcaltaL.）是豆科苜蓿屬多年生草本植物，廣泛分布于亞洲和歐洲，是我國北方草原的優(yōu)良牧草，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠等特性，是苜?？剐杂N的重要基因庫。根據(jù)本實驗室龐朝樞構(gòu)建的“黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因縮減雜交文庫”，從中篩選出MfLEAlike的主體片段，克隆出基因編碼區(qū)全長。利用半定量RTPCR技術(shù)，分析該基因在低溫脅迫下的表達規(guī)律。本研究還構(gòu)建了pBIMfLEAlike超表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進行抗逆性及生長狀況分析。通過對MfLEAlike功能進行初步研究，為利用該抗性基因改造其他經(jīng)濟作物提供有益的探索。主要研究結(jié)果如下：MfLEAlike的克隆設(shè)計特異引物，利用RTPCR從冷處理黃花苜蓿葉片cDNA中克隆得到MfLEAlike，全長605bp，含有579bp的開放閱讀框，編碼一個由192個氨基酸組成的蛋白。低溫脅迫對MfLEAlike表達模式的影響MfLEAlike在低溫脅迫下表達量迅速上調(diào)，表明該基因與黃花苜蓿的抗寒性密切相關(guān)。MfLEAlike轉(zhuǎn)化煙草分析構(gòu)建pBIMfLEAlike超表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)分子檢測和鑒定，挑選15株轉(zhuǎn)基因煙草進行Southern雜交，結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)化植株來自不同的轉(zhuǎn)化事件。對T1代轉(zhuǎn)基因煙草進行耐寒性、耐旱性和耐鹽性分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性顯著增強，耐旱性和耐鹽性與野生型差異不大。T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株在生長狀況方面明顯優(yōu)于野生型，該基因的過量表達促進了煙草的生長。作品在何時、何地、何種機構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵無鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫狻彶?、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻的檢索目錄王俊杰,云錦鳳,呂世杰.黃花苜蓿種植的優(yōu)良特性與利用價值[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,29(1):215219.中國農(nóng)科院畜牧所飼料室,農(nóng)漁業(yè)部畜牧局草原處譯.苜蓿的科學(xué)與技術(shù)[C].中國草原學(xué)會論文集第二輯,1986.ALFBENALIMA,ALARYR,JOUDRIERP,eral.parativeexpressionoffiveLeaGenesduringwheatseeddevelopmentandinresponsetoabicticstressesbyrealtimequantitativeRTPCR[J].BiochimBiophysActa,2005,1730(1):5665.DENGJM,JIANLC.Advancesofstudiesonplantfreezingtolerancemechanism:freezingtolerancegeneexpressionanditsfunction[J].ChineseBullerinofBotany,2001,18(5):521530.DESPREZT,AMSELEMJ,CABOCHEM,etal.DifferentialgeneexpressioninArabidopsismonitoredusingcDNAarrays[J].PlantJ,1998,14(5):643652.DUREL.Developmentalbiochemistryofcottonseedembryogenesisandgermination:Changingmessengerribonucleicacidpopulationsasshownbyinvitroandinvivoproteinsynthesis.Biochemistry,1981,20:4162.DURELⅢ.TheLeaProteinofHighPlants.In:Verma,DeshPalS,ed.ControlofPlantGeneExpression,Florida:CRCPressInc,1993,325335.GARAYARROYOA,CCLMENEROFLORESJM,GARCIARRLBIOA,etal.Highlyhydrophilicproteinsinprokaryotesandeukaryotesaremonduringconditionsofwaterdeficit[J].JBiolChem,2000,275:56685674.GuoZ,BonosS,MeyerW,etal.Transgeniccreepingbentgrasswithdelayeddollarspotsymptoms.MolBreeding,2003,11(2):95101.INGRAMJ,BARTELSD.Themolecularbasisofdehydrationtoleranceinplants[J].AnnuRevPlantPhysiolPlatMolBiol,1996,47:377403.LINSHIJIE,LIJUNTAO,JIANGJING,etal.LowToleranceAnalysisofTransgenicTobaccoWithLateEmbryogenesisAbundantProteinGenefromTamatixsp[J].LETTERSINBIOTECHNOLOGY,2006,14(4):563566.LIUTIANTIAN,YUYING,ZHAOXIN,etal.AnalysisofNaHCO3ResistancetoTransgenicTabaccoHarboringleaGene[J].MolecularPlantBreeding,2006,14(2):216222.MCKENZIEJS,MCLEANGE.Theimportanceofleaffrostresistancetothewintersurvivalofseedingofalfalfa.CanadianJoumalofPlantScience,1982,62(2):399405.SAGHAIMA,etal.RibosomalDNAspacerlenthpolymorphismsinbarley:Mendelianinheritance,chromosomallocationandpopulationdynamics.ProcNatlAcadSciUSA,1984,81:8014.SHINOZAKIK,etal.Geneexpressionandsignaltransductioninwaterstressresponse..PlantPhysiology,1997,115:327.SWIRECLARKGA,MARCOTLEWRJ.ThewheatLEAproteinEmfunctionsasanosmoprotectivemoleculeinsacharomycescerevi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C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。干旱、鹽漬及低溫是制約植物生長、降低其產(chǎn)量的三大非生物因素。其中，低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍，同時還會造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴重時甚至絕收。全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)作物損失高達數(shù)千億元（DENGJM等,2001）。干旱、鹽漬和低溫都能引起植物水分虧缺,進而誘導(dǎo)植物體內(nèi)積累一系列蛋白質(zhì)保護細胞免受脫水傷害（GARAYARROYOA等,2000）,其中LEA蛋白的積累最為普遍。1981年,Dure在胚胎發(fā)育后期的棉花子葉中分離到了一組含量豐富的mRNA,命名LeamRNA，其轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物為lateembryogenesisabundantproteins,簡稱LEA蛋白。后來,許多LEA蛋白或它們的基因在不同的植物包括大麥、小麥、擬南芥、水稻、玉米和大豆等中被發(fā)現(xiàn)（SWIRECLARKGA等,1999）。研究表明，LEA蛋白是胚胎發(fā)育后期隨著種子成熟休眠過程形成的一類低分子量蛋白質(zhì)，廣泛存在于高等植物種子內(nèi)（DURELⅢ,1993）。此外許多營養(yǎng)組織在低溫脅迫、外源脫落酸(ABA)或滲透壓改變的誘導(dǎo)下也能產(chǎn)生特異LeamRNA和LEA蛋白(ALFBENALIMA等,2005)。LEA蛋白顯著的理化特性是具有很強的親水性和熱穩(wěn)定性,即使在煮沸的情況下也能保持水溶狀態(tài)(DESPREZT,1998)。因LEA蛋白具有高度的親水性，能把足夠的水分捕獲到細胞內(nèi)，從而保護細胞免受水分脅迫的傷害(INGRAMJ,1996)。研究表明LEA基因表達或蛋白累積與植物的滲透脅迫抗性呈正相關(guān)(XUQ等,1996)，此外在植物耐寒、耐鹽性方面也發(fā)揮重要作用。因此，LEA蛋白成為當(dāng)前植物逆境生理學(xué)研究熱點之一，受到廣泛重視，在植物抗逆性調(diào)節(jié)、基因工程抗性育種等方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。黃花苜蓿（MedicagofalcaltaL.），別名野苜蓿、鐮莢苜蓿，是豆科苜蓿屬多年生草本植物，廣泛分布于亞洲和歐洲，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠等特性，是苜?？剐杂?/p>