DB31T 1160-2019 畜禽養(yǎng)殖過程細菌耐藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

畜禽養(yǎng)殖過程細菌耐藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范2019-06-14發(fā)布2019-07-01實施上海市市場監(jiān)督管理局發(fā)布■I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由上海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并組織實施。本標準由上海市畜牧標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：上海市動物疫病預(yù)防控制中心。1下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析實驗室用水CLSIM100抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(PerformanceStandardsforAntimicrobi用于測試抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制或殺滅作用的試驗。藥定量檢測某一抗菌藥物對動物源性細菌的體外抑菌活性的一種系列倍比稀釋濃度的抗菌藥物，通過加入待檢細菌的菌懸液，經(jīng)一定數(shù)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到MIC值。根據(jù)美國臨床試驗室標準化委員會(CLSI)的相應(yīng)標準獲得待檢菌對某2折點breakpoint用以區(qū)分菌株敏感、中介還是耐藥的最低抑菌濃度或抑菌圈直徑。4設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料見附錄A中A.1。5試劑和培養(yǎng)基除非另有說明，水應(yīng)符合GB/T6682三級水的規(guī)定。5.2氯化鈉溶液無菌0.85%氯化鈉溶液制備方法見A.2?？咕幬锓N類及貯備液和工作液的制備與保存見A.3。本標準采用的培養(yǎng)基如下：—大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基),制備見B.3;—緩沖蛋白胨水，制備見B.4?！抽T氏菌顯色培養(yǎng)基(膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基),制備見B.6。 腸球菌顯色培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基),制備見B.7。——7.5%氯化鈉肉湯，制備見B.8。 金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基),制備見B.9。Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯),制備見B.10。本標準中常用的質(zhì)控菌株如下：——大腸埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922); 沙門氏菌(Salmonella,ATCC35218或CVCC5——糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC29212);—金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC29213)。質(zhì)控菌株使用的代次應(yīng)為3代～5代，一60℃以下超低溫冰箱保存。6操作步驟滅菌棉拭子一端插入家畜肛門或家禽泄殖腔1.5cm~2.0cm,旋轉(zhuǎn)2圈~3圈，沾上糞便后，將棉3拭子置于10mL運送培養(yǎng)基中。采集的樣品于0℃~4℃保存，并使用密封保溫容器運送。糞便拭子保存時間不超過48h,生鮮乳樣品保存時間不超過24h?！抽T氏菌屬細菌分離與鑒定見D.2;—金黃色葡萄球菌分離與鑒定見D.4。將質(zhì)控菌株和測試菌株分別轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h以得到單個純將抗菌藥物貯備液用無菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯按附錄A稀釋至工作濃度，使用同樣稀無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，挑取培養(yǎng)18h～24h的純菌落3個~5個，轉(zhuǎn)移至含2mL～3mL無菌0.85%氯化鈉溶液或M-H肉湯的試管中混勻，用濁度儀或標準比濁管校正菌液濃度至0.5麥氏單位(細菌含量約為1×10?CFU/mL～2×10?CFU/mL),將調(diào)節(jié)至0.5麥氏單位的菌液用M-H肉湯稀釋4將接種完畢的96孔藥敏板置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育16h~20h。7結(jié)果觀察和記錄自培養(yǎng)箱中取出藥敏板，置于襯有黑底板的光線下用肉眼觀察結(jié)果。如果無法辨別孔中是否有細菌生長時可使用觀察裝置幫助進行結(jié)果的判讀。在無菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物溶液的濃度如藥敏板上陰性對照孔內(nèi)無細菌生長，液體未見渾濁；陽性對照孔內(nèi)有敏板結(jié)果有效，可繼續(xù)判讀菌株MIC。如陰性孔或陽性孔異常，則該藥敏板結(jié)果無效。如藥敏板結(jié)果有效，且質(zhì)控菌株MIC在規(guī)定范圍內(nèi)，則本次試驗結(jié)果有效，可繼續(xù)判讀樣品藥敏結(jié)果。如質(zhì)控菌株MIC不在規(guī)定范圍內(nèi)，則本次試驗結(jié)果無效。先進行試驗結(jié)果有效性判斷，在試驗結(jié)果有效的前提下，繼續(xù)判讀樣品MIC,判讀完成后進行8質(zhì)量控制和結(jié)果判定每次藥敏試驗均應(yīng)采用合適的質(zhì)控菌株進行質(zhì)量控制，質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定范圍。質(zhì)控菌株的實驗結(jié)果符合規(guī)定的前提下，按照附錄F中F.1～F.3標準判定測試菌株的敏感性—敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)。對于只給出敏感判斷標準的藥物，只報告其是否敏感即可。9菌種保存及生物安全措施實驗分離的菌株應(yīng)由具備相關(guān)資質(zhì)的實驗室妥善保存。實驗過程及廢棄物處理應(yīng)嚴格按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5(資料性附錄)設(shè)備和材料A.1設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：——一次性接種環(huán)；——無菌培養(yǎng)皿；——無菌試管；——容量瓶；——麥氏比濁管或濁度儀；——冰箱：0℃~4℃和—60℃以下；——電子天平：感量0.01g,感量0.00001g;——渦旋儀；——生物安全柜；——微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化鑒定試條；——PCR擴增儀。A.2無菌0.85%氯化鈉溶液稱取0.85g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，115℃滅菌30min。A.3抗菌藥物照品或標準品。A.3.2抗菌藥物貯備液的制備與保存：精密稱定抗菌藥物標準品或?qū)φ掌愤m量，加入一定量的溶劑制成1000μg/mL(或最高測試濃度的10倍)的貯備液，置—60℃以下保存，有效期為半年。A.3.3抗菌藥物工作液的制備：測試的濃度范圍取決于細菌的種類和抗菌藥物，選擇的范圍應(yīng)覆蓋參考菌株的MIC終點。使用M-H肉湯和兩倍稀釋法將抗菌藥物制成0.03μg/mL～2048μg/mL之間的一系列濃度梯度，具體濃度范圍見表A.1。6表A.1抗菌藥物濃度范圍稀釋濃度范圍/(μg/mL)稀釋濃度范圍/(μg/mL)阿莫西林阿莫西林恩諾沙星四環(huán)素頭孢他定恩諾沙星甲氧芐啶甲氧芐啶多西環(huán)素替米考星乙酰甲喹7(資料性附錄)B.1運送培養(yǎng)基運輸培養(yǎng)基成分見表B.1。氯化鈉磷酸二氫鈉(NazHPO?·12H?O)氯化鈣0.1g稱取表B.1中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至8.4±0.1,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分見表B.2。表B.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨牛肉浸膏氯化鈉稱取表B.2中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,121℃高壓滅菌15min,冷至50℃,搖勻后傾注平板。8B.3大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基成分見表B.3。表B.3麥康凱瓊脂培養(yǎng)基成分明膠胰酶水解物胨(或酪蛋白)氯化鈉中性紅結(jié)晶紫B.3.2制法稱取表B.3中各成分加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。緩沖蛋白胨水成分見表B.4。表B.4緩沖蛋白胨水成分蛋白胨氯化鈉磷酸二氫鈉(Na?HPO?·12H?O)磷酸二氫鉀(KH?PO?)B.4.2制法稱取表B.4中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。9B.5氯化鎂-孔雀綠增菌液B.5.1溶液A溶液A成分見表B.5。表B.5溶液A成分氯化鈉磷酸二氫鉀B.5.1.2制法稱取表B.5中各成分加入1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0,加熱至70℃溶解。此溶液使用前在4℃冰箱儲存不超過24h。B.5.2溶液B溶液B成分見表B.6。表B.6溶液B成分氯化鎂(MgCl2·6H?O)B.5.2.2制法按照表B.6用量將MgCl?·6H?O溶于1000mL蒸餾水中。B.5.3溶液C溶液C成分見表B.7。表B.7溶液C成分蒸餾水按照表B.7將孔雀綠溶于100mL蒸餾水中。溶液可室溫保存于棕色玻璃瓶中。B.5.4完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基成分見表B.8。表B.8完全培養(yǎng)基成分溶液B溶液C按表B.8比例配制，調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為5.2,分裝于試管中，每管10mL。115℃高壓滅菌B.6沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基)B.6.1成分膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基成分見表B.9。表B.9膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基成分蛋白胨牛肉浸膏去氧膽酸鈉中性紅稱取表B.9中除中性紅和瓊脂以外各成分溶于400mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2,再將瓊脂于600mL蒸餾水中煮沸至完全溶解，兩液合并，加入0.5%中性紅溶液6mL,待冷至50℃,搖勻后傾注平板。B.7腸球菌顯色培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基)膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基成分見表B.10。表B.10膽汁七葉苷疊氦鈉瓊脂培養(yǎng)基成分牛肉浸膏酵母浸膏牛膽粉氯化鈉疊氮化鈉稱取表B.10中各成分溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,121℃高壓滅菌15min,于45℃~50℃保溫培養(yǎng)基，從保溫開始至傾注平板的時間不應(yīng)超過4h。B.87.5%氯化鈉肉湯7.5%氯化鈉肉湯成分見表B.11。表B.117.5%氯化鈉肉湯成分蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉B.8.2制法稱取表B.11中各成分加熱溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1,分裝于三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min備用。B.9金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基)Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基成分見表B.12。表B.12Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基成分牛肉膏酵母膏丙酮酸鈉氯化鋰(LiCl·6H?O)B.9.2增菌劑30%卵黃鹽水50mL與通過0.22μm孔徑濾膜進行過濾除菌的1%的亞碲酸鉀10mL混合，4℃冰箱保存。B.9.3制法稱取表B.12中各成分至1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2,分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱融化瓊脂，冷至50℃,每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞硒酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在4℃冰箱儲存不應(yīng)超B.10Mueller-Hinton肉湯(M-H肉湯)B.10.1成分M-H肉湯的成分見表B.13。牛肉浸出粉酪蛋白水解物稱取表B.13各成分加入蒸餾水1000mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2,分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min,定量(等體積)分裝于滅菌試管中。(資料性附錄)采樣登記表畜禽養(yǎng)殖抗菌藥物使用情況采樣登記表見表C.1。表C.1畜禽養(yǎng)殖抗菌藥物使用情況采樣登記表采樣時間姓名電話□注射□飲水□拌料□注射□飲水口拌料□注射□飲水□拌料(資料性附錄)D.1大腸埃希菌分離與鑒定棉拭子接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，顯色培養(yǎng)基上純化一代，純化后可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進行生化鑒定。大腸埃希菌分離與鑒定流程圖見圖D.1。動物肛門或泄殖腔拭子動物肛門或泄殖腔拭子運送培養(yǎng)基接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h挑取大腸埃希菌可疑菌落純化大腸埃希菌圖D.1大腸埃希菌分離與鑒定流程圖D.2沙門氏菌屬細菌分離與鑒定棉拭子置于緩沖蛋白胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,取100μL預(yù)增菌液置于10mL氯化鎂-孔雀綠培養(yǎng)基中，42℃±1℃培養(yǎng)22h～24h,隨后將增菌液混勻，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，42℃±1℃培養(yǎng)22h～24h,挑取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上無色半透明或粉紅色，菌落中心黑色或幾乎全黑色的可疑菌落，接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對已純化的菌落，應(yīng)使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進行生化鑒定。沙門氏菌屬細菌分離與鑒定流程圖見圖D.2。或者通過附錄E的方法進行分子生物學(xué)運送培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水預(yù)增菌，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h接種氯化鎂一孔雀綠增菌液，42℃±1℃,培養(yǎng)22h～24h生化鑒定PCR鑒定圖D.2沙門氏菌屬細菌分離與鑒定流程圖D.3腸球菌屬細菌分離與鑒定棉拭子接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,挑取褐色可疑菌落，顯色培養(yǎng)基上純化一代，純化后可疑菌落接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化一代。對于已純化的菌落，使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或生化試條進行生化鑒定。腸球菌屬細菌分離與鑒定流程圖見圖D.3。接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃,培養(yǎng)18h～24h圖D.3腸球菌屬細菌分離與鑒定流程圖取1mL生鮮乳樣品至9mL?.5%氯化鈉肉湯中，振蕩混勻后36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,將培養(yǎng)物劃線接種到金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,挑取灰黑色至黑色可疑菌落化鑒定。金黃色葡萄球菌分離與鑒定流程圖見11mL生鮮乳+9mL7.5%氯化鈉肉湯，混勻后金黃色葡萄球菌5×TBE緩沖液成分見表E.1。乙二酸四乙酸二鈉用接種環(huán)從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑選16h～24h的純培養(yǎng)物，置于0.5mL滅菌生理鹽水中，12000r/min離心2min,棄上清液。再加0.5mL滅菌蒸餾水，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷卻后以12000r/min離心2min,取上清液為PCR模板。陰性對照模板為滅菌95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環(huán)，最后72℃延伸電壓110V,電泳時間30min。如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與沙門氏菌陽性對照的條帶在一(資料性附錄)細菌對常見抗菌藥物的判斷標準和質(zhì)控范圍F.1大腸埃希菌和沙門氏菌屬細菌對常見抗菌藥物的折點判斷標準和質(zhì)控范圍見表F.1。表F.1大腸埃希菌和沙門氏菌屬細菌對常見抗菌藥物的折點判斷標準和質(zhì)控范圍臨床折點判斷標準*質(zhì)控菌株MIC范圍SIRβ-內(nèi)酰胺類β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶阿莫西林/克拉維酸4頭孢他啶828四環(huán)素類多西環(huán)素8四環(huán)素84葉酸合成抑制劑一甲氧芐啶/磺胺甲呼唑一恩諾沙星 大腸埃希菌4多肽類4喹噁啉類乙酰甲喹一一一一b“--”表示