重組技術(shù)的基本工具

專題1基因工程第一節(jié)DNA重組技術(shù)基礎(chǔ)工具教材預(yù)覽導(dǎo)言基因工程是指根據(jù)大家愿望,進(jìn)行嚴(yán)格設(shè)計(jì),并經(jīng)過＿＿＿＿和＿＿＿＿等技術(shù),給予生物以新＿＿＿＿,從而發(fā)明出更符合大家需要新生物類型和生物產(chǎn)品。因?yàn)榛蚬こ淌窃贒NA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工,所以又叫做＿＿＿＿。思索:①基因工程別名？其操作環(huán)境、對象、水平及基礎(chǔ)過程?②基因工程實(shí)質(zhì)及結(jié)果？提醒:①基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù);生物體外;基因;DNA分子水平;剪切→拼接→導(dǎo)入→表示。②基因重組;人類需要基因產(chǎn)物。DNA重組技術(shù)操作過程最少需要三種工具,即＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿。思索:處理培育抗蟲棉關(guān)鍵步驟上一樣需要這三種工具嗎？提醒:一樣需要。限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA工具是＿＿＿＿,又稱＿＿＿＿。這類酶關(guān)鍵是從＿＿＿＿生物中分離純化出來。它們能夠識(shí)別雙鏈DNA分子某種＿＿＿＿序列,而且使每一條鏈中特定部位兩個(gè)核苷酸之間＿＿＿＿鍵斷開。大多數(shù)限制酶識(shí)別序列由＿＿＿＿個(gè)核苷酸組成。DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生DNA片段末端通常有兩種形式,即＿＿＿＿和＿＿＿＿。思索:限制酶廣泛分布于多種生物中嗎？提醒:關(guān)鍵分布于微生物中。DNA連接酶將切下來DNA片段拼接成新DNA分子,是靠＿＿＿＿來完成。依據(jù)酶起源不一樣,可將這些酶分為兩類:＿＿＿＿和＿＿＿＿。這兩類酶都是恢復(fù)被＿＿＿＿切開了兩個(gè)核苷酸之間＿＿＿＿,但這兩種酶在性質(zhì)上有差異:前者只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)＿＿＿＿之間連接起來,不能將雙鏈DNA片段＿＿＿＿之間進(jìn)行連接;后者既能夠“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)＿＿＿＿,又能夠“縫合”雙鏈DNA片段＿＿＿＿,但連接平末端之間效率比較低。思索:DNA連接酶是將兩個(gè)黏性末端哪兩個(gè)連接在一起？提醒:磷酸基和脫氧核糖。基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體是＿＿＿＿等,它是一個(gè)裸露、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于＿＿＿＿（即擬核DNA）之外,并含有＿＿＿＿能力＿＿＿＿DNA分子。在其DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)＿＿＿＿位點(diǎn),供＿＿＿＿（基因）插入其中。攜帶外源DNA片段＿＿＿＿進(jìn)入受體細(xì)胞后,停留在＿＿＿＿中進(jìn)行自我復(fù)制,或整合到染色體DNA上,隨＿＿＿＿進(jìn)行同時(shí)復(fù)制。在其DNA分子上有特殊＿＿＿＿基因,如抗四環(huán)素等標(biāo)識(shí)基因,供重組DNA判定和選擇。載體除質(zhì)粒外,還有＿＿＿＿等。思索:質(zhì)粒被用作載體理由？提醒:能復(fù)制;含有標(biāo)識(shí)基因;含有多個(gè)限制酶切點(diǎn)。預(yù)覽答案體外DNA重組轉(zhuǎn)基因遺傳特征DNA重組技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體限制性核酸內(nèi)切酶限制酶原核特定核苷酸磷酸二酯6黏性末端平末端DNA連接酶E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶限制酶磷酸二酯鍵黏性末端平末端黏性末端平末端質(zhì)粒細(xì)菌染色體自我復(fù)制雙鏈環(huán)狀限制酶切割外源DNA片段質(zhì)粒細(xì)胞染色體DNA遺傳標(biāo)識(shí)動(dòng)植物病毒問題探討下圖是基因工程培育抗蟲棉簡明過程:蘇云金芽孢桿菌↓提取與運(yùn)載體DNA拼接一般棉花(無抗蟲特征)抗蟲基因——————→棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)導(dǎo)入棉花植株(有抗蟲特征)試述培育抗蟲棉關(guān)鍵步驟是什么？處理培育抗蟲棉關(guān)鍵步驟需要哪些工具？提醒:關(guān)鍵步驟一:抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來;工具一:基因剪刀——限制性內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟二:抗蟲基因與運(yùn)載體DNA連接;工具二:基因針線——DNA連接酶關(guān)鍵步驟三:抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞;工具三:基因運(yùn)載工具——運(yùn)載體學(xué)習(xí)過程基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程?；蚬こ淌窃谏锘瘜W(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來,正是這些學(xué)科基礎(chǔ)理論和相關(guān)技術(shù)發(fā)展催生了生物工程。一“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶1、概念及起源:關(guān)鍵是從原核生物中分離純化出來一個(gè)酶。能將外來DNA切斷,因?yàn)檫@種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行,故名限制性內(nèi)切酶。2、種類:約4000種3、作用:識(shí)別雙鏈DNA分子某種特定核苷酸序列,而且使每一條鏈中特定部位兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵斷開。4、組成:大多數(shù)限制酶識(shí)別序列有6個(gè)核苷酸組成,少數(shù)由4、5或8個(gè)核苷酸組成。5、結(jié)果:DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)將DNA兩條鏈分別切開時(shí),產(chǎn)生是黏性末端,而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列中心軸線切開時(shí),產(chǎn)生則是平末端。6、限制酶識(shí)別序列和切開部位特點(diǎn):其所識(shí)別序列均可找到一條中軸線,兩側(cè)雙鏈DNA上堿基是反向?qū)ΨQ反復(fù)排列;任一個(gè)限制酶因其本身性質(zhì)所決定,都只識(shí)別和切斷特定核苷酸序列,而不是在任何部位都能將DNA切開。思索與討論1.要想取得某個(gè)特定性狀基因必需要用限制酶切多個(gè)切口？可產(chǎn)生多個(gè)黏性末端？提醒:要切兩個(gè)切口,產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。2.假如把兩種起源不一樣DNA用同一個(gè)限制酶來切割,會(huì)怎樣呢？提醒:會(huì)產(chǎn)生相同黏性末端,然后讓二者黏性末端黏合起來,就似乎能夠合成重組DNA分子了。例題下列相關(guān)限制酶說法正確是（）限制酶廣泛存在于多種生物中,微生物中分布很多一個(gè)限制酶只能識(shí)別一個(gè)特定核苷酸序列不一樣限制酶切割DNA后都會(huì)形成黏性末端限制酶作用部位是特定核苷酸形成氫鍵解析:限制性核酸內(nèi)切酶也稱限制酶,關(guān)鍵從原核生物中分離純化出來,它能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列,而且使每一條鏈中特定部位兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵斷開。答案:B例題下圖為一個(gè)限制酶切割DNA分子示意圖。請據(jù)圖回復(fù):（1）這種限制酶切點(diǎn)是＿＿＿＿,形成＿＿＿＿個(gè)＿＿＿＿末端,特點(diǎn)是＿＿＿＿。（2）從上題可知限制酶識(shí)別特點(diǎn)是＿＿＿＿。（3）假如G發(fā)生突變可能發(fā)生＿＿＿＿。解析:該限制酶識(shí)別核苷酸序列是GAATTC,專一切口是G和A。切出兩個(gè)完全相同黏性末端是AATT和TTAA,兩個(gè)黏性末端關(guān)系是堿基互補(bǔ)配對。答案:（1）GA2黏性堿基互補(bǔ)配對（2）只能識(shí)別某一個(gè)特定核苷酸序列（3）限制性核酸內(nèi)切酶不能識(shí)別切割位點(diǎn)。同時(shí)拓展限制性內(nèi)切酶功效和種類:限制性內(nèi)切酶關(guān)鍵功效是保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體感染,這一見解已被人們廣泛接收。它們作為微生物免疫機(jī)制一部分行使其功效。當(dāng)一個(gè)沒有限制性內(nèi)切酶細(xì)菌被病毒感染時(shí),大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個(gè)有限制性內(nèi)切酶同種細(xì)菌被成功感染比率顯著下降。出現(xiàn)更多限制性內(nèi)切酶將會(huì)起到多重保護(hù)作用;而擁有4到5種各自獨(dú)立限制性內(nèi)切酶將會(huì)使細(xì)胞堅(jiān)不可摧。限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現(xiàn)。后者作用是保護(hù)細(xì)胞本身DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識(shí)別位點(diǎn)與對應(yīng)限制性內(nèi)切酶相同,但只甲基化每條鏈中一個(gè)堿基,而不是切開DNA鏈。限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)處甲基基團(tuán)伸入到雙螺旋大溝中去,阻礙了限制性內(nèi)切酶作用。這么,限制性內(nèi)切酶和它“搭檔”-甲基化酶一起就組成了限制-修飾（R-M）系統(tǒng)。在部分R-M系統(tǒng)中,限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不一樣蛋白質(zhì),它們各自獨(dú)立行使自己功效;而在另部分系統(tǒng)中,兩種功效由同一個(gè)限制-修飾酶不一樣亞基,或是同一亞基不一樣結(jié)構(gòu)域來實(shí)施。限制性內(nèi)切酶關(guān)鍵分成四大類:第一類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一核苷酸次序,并在識(shí)別點(diǎn)周圍部分核苷酸上切割DNA分子中雙鏈,不過切割核苷酸次序沒有專一性,是。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處,無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。第二類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一核苷酸次序,并在該次序內(nèi)固定位置上切割雙鏈。因?yàn)檫@類限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割核苷酸都是專一。所以總能得到一樣核苷酸次序DNA片段,并能構(gòu)建來自不一樣基因組DNA片段,形成雜合DNA分子。所以,這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常見工具酶之一。第三類限制性內(nèi)切酶識(shí)別次序是一個(gè)回文對稱次序,即有一個(gè)中心對稱軸,從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶切割能夠有兩種方法。一是交錯(cuò)切割,結(jié)果形成兩條單鏈末端,這種末端核苷酸次序是互補(bǔ),可形成氫鍵,所以稱為黏性末端。另一個(gè)是在同一位置上切割雙鏈,產(chǎn)生平末端。第四類限制性內(nèi)切酶也有專一識(shí)別次序,但不是對稱回文次序。它在識(shí)別次序旁邊多個(gè)核苷酸對固定位置上切割雙鏈。但這多個(gè)核苷酸對則是任意。所以,這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生一定長度DNA片段,含有多種單鏈末端。這對于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。例題下列相關(guān)限制酶說法不正確是（）A、限制酶關(guān)鍵存在于微生物中B、限制酶關(guān)鍵功效是保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體感染C、當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列中心軸線處切開時(shí),產(chǎn)生則是黏性末端D、不一樣限制酶切割DNA切點(diǎn)不一樣解析:限制酶切割有兩種方法,一是交錯(cuò)切割,結(jié)果形成黏性末端;另一個(gè)是在識(shí)別序列中心軸處切開,產(chǎn)生平末端。答案:C二、“分子縫合針”——DNA連接酶1、概念:將兩條DNA鏈連接起來酶2、種類:依據(jù)酶起源不一樣,分為兩類:一類是從大腸桿菌中分離得到,稱為E.coliDNA連接酶;另一類是從T4噬菌體中分離出來,稱為T4DNA連接酶。3、作用:DNA連接酶是將雙鏈DNA片段“縫合”起來,恢復(fù)被限制酶切開了兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵。4、兩種DNA連接酶差異:E.coliDNA只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間連接起來,不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接。而T4DNA連接酶既能夠“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端,又能夠“縫合”雙鏈DNA片段平末端,但連接平末端之間效率較低。5、DNA連接酶與DNA聚合酶區(qū)分和聯(lián)絡(luò):基因工程中所用DNA連接酶催化反應(yīng)都是連接雙鏈DNA缺口,而不能連接單鏈DNA,DNA聚合酶和DNA連接酶都能形成磷酸二酯鍵,不過二者作用是有差異,表現(xiàn)在兩個(gè)方面:DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已經(jīng)有核酸片段3’例題如圖所表示,兩個(gè)核酸片段在適宜條件下,經(jīng)X酶催化作用,發(fā)生下述改變,則X酶是（）……A-C-GA-A-T-T-C-G-T…………T-G-C-T-T-A-AG-C-A……↓X酶A-C-G-A-A-T-T-C-G-TT-G-C-T-T-A-A-G-C-AA.連接酶B.RNA聚合酶C.DNA聚合酶D、限制酶解析:DNA連接酶作用是將兩個(gè)黏性末端磷酸基和脫氧核糖連接在一起;RNA聚合酶是在RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程中,把核糖核苷酸連接在一起;DNA聚合酶是在DNA復(fù)制過程中催化脫氧核苷酸聚合反應(yīng);限制酶作用是在獲取目基因時(shí)識(shí)別特定核苷酸序列,而且使每一條鏈中特定部位兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵斷開。答案:A三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體1、作用:一是作為運(yùn)載工具,將目基因送到宿主細(xì)胞中去;二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目基因進(jìn)行大量復(fù)制。2、條件:能自我復(fù)制;能在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保留;含有一到多個(gè)限制酶切點(diǎn),便于和外源基因連接;含有標(biāo)志基因,便于判定和選擇。3、種類:現(xiàn)在所用運(yùn)載體關(guān)鍵有兩類:一類是細(xì)菌質(zhì)粒,它是一個(gè)相對分子質(zhì)量較小、獨(dú)立于染色體DNA之外環(huán)狀DNA,有細(xì)菌中有一個(gè),有細(xì)菌中有多個(gè)。質(zhì)粒經(jīng)過細(xì)菌間結(jié)合由一個(gè)細(xì)菌向另一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移,能夠獨(dú)立復(fù)制,也能夠整合到細(xì)菌染色體DNA中,伴隨染色體DNA復(fù)制而復(fù)制。另一類運(yùn)載體是噬菌體或一些病毒。現(xiàn)在大家還在不停尋求新運(yùn)載體,如葉綠體或線粒體DNA等也可能成為運(yùn)載體。4、結(jié)果:質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中（復(fù)制表示）能夠整合到細(xì)胞核染色體上例題下列哪項(xiàng)不是基因工程中常常使用運(yùn)載目基因載體（）A、細(xì)菌質(zhì)粒B、噬菌體C、細(xì)菌核區(qū)中DNAD、動(dòng)植物病毒解析:基因工程中通常見質(zhì)粒作為載體,質(zhì)粒是一個(gè)裸露、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外,并含有自我復(fù)制能力雙鏈環(huán)狀DNA分子,在基因工程中使用載體除質(zhì)粒外,還有噬菌體或一些病毒等,它們起源不一樣,在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段大小上也有很大差異。答案:C同時(shí)拓展運(yùn)載體要讓一個(gè)從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表示,首先得將這個(gè)基因送到乙生物細(xì)胞內(nèi)去。能將外源基因送入細(xì)胞工具就是運(yùn)載體。作用:將外源基因送入受體細(xì)胞。條件:能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保留;具多個(gè)限制酶切點(diǎn),方便與外源基因連接;含有一些標(biāo)識(shí)基因,便于進(jìn)行篩選,如抗菌素抗性基因、產(chǎn)物含有顏色反應(yīng)基因等。種類:質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。大腸桿菌質(zhì)粒:最常見質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒,其中常含有抗藥基因,如四環(huán)素標(biāo)識(shí)基因。質(zhì)粒存在是否對宿主細(xì)胞生存沒有決定性作用,但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。質(zhì)粒特點(diǎn):細(xì)胞染色體（或擬核DNA分子）外能自主復(fù)制小型環(huán)狀DNA分子;質(zhì)粒存在對宿主細(xì)胞無影響;質(zhì)粒復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒步驟:從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA方法都包含3個(gè)基礎(chǔ)步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增;搜集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。采取溶菌酶能夠破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶、SDS和TritonX-100處理后,細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上,同時(shí)因?yàn)榧?xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機(jī)械力和核酸酶等作用而被切斷成不一樣大小線狀片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí),細(xì)菌線狀染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA兩條鏈不會(huì)相互分開,當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí),線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形整天然超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中,除了超螺旋DNA外,還會(huì)產(chǎn)生其她形式質(zhì)粒DNA。假如質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈張力,形成松弛型環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA（ocDNA）;假如質(zhì)粒DNA兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA。當(dāng)提取質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子泳動(dòng)速度快。例題下列相關(guān)基因工程中載體說法正確是（）在進(jìn)行基因工程操作中,被用作載體質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒全部質(zhì)粒都能夠作為基因工程中載體質(zhì)粒是一個(gè)獨(dú)立于細(xì)菌染色體外鏈狀DNA分子質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行判定和選擇標(biāo)識(shí)基因解析: