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文檔簡介

PAGEPAGE1克隆技術(shù)探討現(xiàn)狀一、克隆的早期探討克隆一詞是英文單詞clone的音譯,作為名詞,c1one通常被意譯為無性繁殖系。同一克隆內(nèi)全部成員的遺傳構(gòu)成是完全相同的,例外僅見于有突變發(fā)生時(shí)。自然界早已存在自然植物、動(dòng)物和微生物的克隆,例如:同卵雙胞胎事實(shí)上就是一種克隆。然而,自然的哺乳動(dòng)物克隆的發(fā)生率極低,成員數(shù)目太少(一般為兩個(gè)),且缺乏目的性,所以很少能夠被用來為人類造福,因此,人們起先探究用人工的方法來生產(chǎn)高等動(dòng)物克隆。這樣,克隆一詞就起先被用作動(dòng)詞,指人工培育克隆動(dòng)物這一動(dòng)作。目前,生產(chǎn)哺乳動(dòng)物克隆的方法主要有胚胎分割和細(xì)胞核移植兩種??寺⊙颉岸嗬颉?,以及其后各國科學(xué)家培育的各種克隆動(dòng)物,采納的都是細(xì)胞核移植技術(shù)。所謂細(xì)胞核移植,是指將不同發(fā)育時(shí)期的胚胎或成體動(dòng)物的細(xì)胞核,經(jīng)顯微手術(shù)和細(xì)胞融合方法移植到去核卵母細(xì)胞中,重新組成胚胎并使之發(fā)育成熟的過程。與胚胎分割技術(shù)不同,細(xì)胞核移植技術(shù),特殊是細(xì)胞核連續(xù)移植技術(shù)可以產(chǎn)生無限個(gè)遺傳相同的個(gè)體。由于細(xì)胞核移植是產(chǎn)生克隆動(dòng)物的有效方法,故人們往往把它稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。

采納細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動(dòng)物的設(shè)想,最初由漢斯·施佩曼在1938年提出,他稱之為“奇異的試驗(yàn)”,即從發(fā)育到后期的胚胎(成熟或未成熟的胚胎均可)中取出細(xì)胞核,將其移植到一個(gè)卵子中。這一設(shè)想是現(xiàn)在克隆動(dòng)物的基本途徑。

從1952年起,科學(xué)家們首先采納青蛙開展細(xì)胞核移植克隆試驗(yàn),先后獲得了蝌蚪和成體蛙。1963年,我國童第周教授領(lǐng)導(dǎo)的科研組,首先以金魚等為材料,探討了魚類胚胎細(xì)胞核移植技術(shù),獲得勝利。

哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞核移植探討的最初成果在1981年取得——卡爾·伊爾門澤和彼得·霍佩用鼠胚胎細(xì)胞培育動(dòng)身育正常的小鼠。1984年,施特恩·維拉德森用取自羊的未成熟胚胎細(xì)胞克隆出一只活產(chǎn)羊,其他人后來利用牛、豬、山羊、兔和獼猴等各種動(dòng)物對(duì)他采納的試驗(yàn)方法進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)。1989年,維拉德森獲得連續(xù)移核二代的克隆牛。1994年,尼爾·菲爾斯特用發(fā)育到至少有120個(gè)細(xì)胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年,在主要的哺乳動(dòng)物中,胚胎細(xì)胞核移植都獲得勝利,包括冷凍和體外生產(chǎn)的胚胎;對(duì)胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的核移植試驗(yàn),也都做了嘗試。但到1995年為止,成體動(dòng)物已分化細(xì)胞核移植始終未能取得勝利。二、克隆羊“多莉”的意義和引起的反響

以上事實(shí)說明,在1997年2月英國羅斯林探討所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多莉”培育勝利之前,胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。事實(shí)上,“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細(xì)胞核移植的全部過程,但這并不能減低“多莉”的重大意義,因?yàn)樗鞘澜缟系谝焕?jīng)體細(xì)胞核移植誕生的動(dòng)物,是克隆技術(shù)領(lǐng)域探討的巨大突破。這一巨大進(jìn)展意味著:在理論上證明白,同植物細(xì)胞一樣,分化了的動(dòng)物細(xì)胞核也具有全能性,在分化過程中細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)沒有不行逆變更;在實(shí)踐上證明白,利用體細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物克隆的技術(shù)是可行的,將有多數(shù)相同的細(xì)胞可用來作為供體進(jìn)行核移植,并且在與卵細(xì)胞相融合前可對(duì)這些供體細(xì)胞進(jìn)行一系列困難的遺傳操作,從而為大規(guī)模復(fù)制動(dòng)物優(yōu)良品種和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物供應(yīng)了有效方法。

在理論上,利用同樣方法,人可以復(fù)制“克隆人”,這意味著以往科幻小說中的獨(dú)裁狂人克隆自己的想法是完全可以實(shí)現(xiàn)的。因此,“多莉”的誕生在世界各國科學(xué)界、政界乃至宗教界都引起了劇烈反響,并引發(fā)了一場由克隆人所衍生的道德問題的探討。各國政府有關(guān)人士、民間紛紛作出反應(yīng):克隆人類有悖于倫理道德。盡管如此,克隆技術(shù)的巨大理論意義和好用價(jià)值促使科學(xué)家們加快了探討的步伐,從而使動(dòng)物克隆技術(shù)的探討與開發(fā)進(jìn)入一個(gè)高潮。三、近3年來克隆探討的重要成果

克隆羊“多莉”的誕生在全世界掀起了克隆探討熱潮,隨后,有關(guān)克隆動(dòng)物的報(bào)道接連不斷。1997年3月,即“多莉”誕生后1個(gè)月,美國、中國臺(tái)灣和澳大利亞科學(xué)家分別發(fā)表了他們勝利克隆猴子、豬和牛的消息。不過,他們都是采納胚胎細(xì)胞進(jìn)行克隆,其意義不能與“多莉”相比。同年7月,羅斯林探討所和PPL公司宣布用基因改造過的胎兒成纖維細(xì)胞克隆出世界上第一頭帶有人類基因的轉(zhuǎn)基因綿羊“波莉”(Polly)。這一成果顯示了克隆技術(shù)在培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的巨大應(yīng)用價(jià)值。

1998年7月,美國夏威夷高校Wakayama等報(bào)道,由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠,其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代,這是繼“多莉”以后的其次批哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植后代。此外,Wakayama等人采納了與“多莉”不同的、新的、相對(duì)簡潔的且勝利率較高的克隆技術(shù),這一技術(shù)以該高校所在地而命名為“檀香山技術(shù)”。

此后,美國、法國、荷蘭和韓國等國科學(xué)家也相繼報(bào)道了體細(xì)胞克隆牛勝利的消息;日本科學(xué)家的探討熱忱尤為驚人,1998年7月至1999年4月,東京農(nóng)業(yè)高校、近畿高校、家畜改良事業(yè)團(tuán)、地方(石川縣、大分縣和鹿兒島縣等)家畜試驗(yàn)場以及民間企業(yè)(如日本最大的奶商品公司雪印乳業(yè)等)紛紛報(bào)道了,他們采納牛耳部、臀部肌肉、卵丘細(xì)胞以及初乳中提取的乳腺細(xì)胞克隆牛的成果。至1999年底,全世界已有6種類型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管/子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代勝利誕生。

2000年6月,中國西北農(nóng)林科技高校利用成年山羊體細(xì)胞克隆出兩只“克隆羊”,但其中一只因呼吸系統(tǒng)發(fā)育不良而早夭。據(jù)介紹,所采納的克隆技術(shù)為該探討組自己探討所得,與克隆“多莉”的技術(shù)完全不同,這表明我國科學(xué)家也駕馭了體細(xì)胞克隆的尖端技術(shù)。

在不同種間進(jìn)行細(xì)胞核移植試驗(yàn)也取得了一些可喜成果,1998年1月,美國威斯康星一麥迪遜高校的科學(xué)家們以牛的卵子為受體,勝利克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎,這一探討結(jié)果表明,某個(gè)物種的未受精卵可以同取自多種動(dòng)物的成熟細(xì)胞核相結(jié)合。雖然這些胚胎都流產(chǎn)了,但它對(duì)異種克隆的可能性作了有益的嘗試。1999年,美國科學(xué)家用牛卵子克隆出珍稀動(dòng)物盤羊的胚胎;我國科學(xué)家也用兔卵子克隆了大熊貓的早期胚胎,這些成果說明克隆技術(shù)有可能成為愛護(hù)和挽救瀕危動(dòng)物的一條新途徑。四、克隆技術(shù)的應(yīng)用前景

克隆技術(shù)已展示出廣袤的應(yīng)用前景,概括起來大致有以下四個(gè)方面:(1)培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)試驗(yàn)動(dòng)物;(2)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物;(3)生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法;(4)復(fù)制瀕危的動(dòng)物物種,保存和傳播動(dòng)物物種資源。以下就生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和胚胎干細(xì)胞作簡要說明。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物探討是動(dòng)物生物工程領(lǐng)域中最迷人和最有發(fā)展前景的課題之一,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為醫(yī)用器官移植的供體、作為生物反應(yīng)器,以及用于家畜遺傳改良、創(chuàng)建疾病試驗(yàn)?zāi)P偷?。但目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)際應(yīng)用并不多,除單一基因修飾的轉(zhuǎn)基因小鼠醫(yī)學(xué)模型較早得到應(yīng)用外,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白的探討時(shí)間較長,已進(jìn)行了10多年,但目前在全世界范圍內(nèi)僅有2例藥品進(jìn)入3期臨床試驗(yàn),5~6個(gè)藥品進(jìn)入2期臨床試驗(yàn);而其農(nóng)藝性狀發(fā)生改良、可資畜牧生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因家畜品系至今沒有誕生。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作效率低、定點(diǎn)整合困難所導(dǎo)致的成本過高和調(diào)控失靈,以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有性繁殖后代遺傳性狀出現(xiàn)分別、難以保持始祖的優(yōu)良勝狀,是制約當(dāng)今轉(zhuǎn)基因動(dòng)物好用化進(jìn)程的主要緣由。

體細(xì)胞克隆的勝利為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)掀起一場新的革命,動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)為快速放大轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所產(chǎn)生的種質(zhì)創(chuàng)新效果供應(yīng)了技術(shù)可能。采納簡便的體細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)施目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移,可以避開家畜生殖細(xì)胞來源困難和低效率。同時(shí),采納轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系,可以在試驗(yàn)室條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)基因整合預(yù)檢和性別預(yù)選。在核移植前,先把目的外源基因和標(biāo)記基因(如LagZ基因和新霉素抗生基因)的融合基因?qū)肱嘤捏w細(xì)胞中,再通過標(biāo)記基因的表現(xiàn)來篩選轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞及其克隆,然后把此陽性細(xì)胞的核移植到去核卵母細(xì)胞中,最終生產(chǎn)出的動(dòng)物在理論上應(yīng)是100%的陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。采納此法,Schnieke等(BioReport,1997)已勝利獲得6只轉(zhuǎn)基因綿羊,其中3只帶有人凝血因子IX基因和標(biāo)記基因(新霉素抗性基因),3只帶有標(biāo)記基因,目的外源基因整合率高達(dá)50%。Cibelli(Science,1997)同樣利用核移植法獲得3頭轉(zhuǎn)基因牛,證明白該法的有效性。由此可以看出,當(dāng)今動(dòng)物克隆技術(shù)最重要的應(yīng)用方向之一,就是高附加值轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的探討開發(fā)。

胚胎干細(xì)胞(ES)是具有形成全部成年細(xì)胞類型潛力的全能干細(xì)胞??茖W(xué)家們始終試圖誘導(dǎo)各種干細(xì)胞定向分化為特定的組織類型,來替代那些受損的體內(nèi)組織,比如把產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)??茖W(xué)家們已經(jīng)能夠使豬ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘鴦?dòng)的心肌細(xì)胞,使人ES細(xì)胞生成神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞和使小鼠ES細(xì)胞分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。這些結(jié)果為細(xì)胞和組織替代療法開拓了道路。目前,科學(xué)家已勝利分別到人ES細(xì)胞(Thomson等1998,Science),而體細(xì)胞克隆技術(shù)為生產(chǎn)患者自身的ES細(xì)胞供應(yīng)了可能。把患者體細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中形成重組胚,把重組胚體外培育到囊胚,然后從囊胚內(nèi)分別出ES細(xì)胞,獲得的ES細(xì)胞使之定向分化為所需的特定細(xì)胞類型(如神經(jīng)細(xì)胞,肌肉細(xì)胞和血細(xì)胞),用于替代療法。這種核移植法的最終目的是用于干細(xì)胞治療,而非得到克隆個(gè)體,科學(xué)家們稱之為“治療克隆”。

克隆技術(shù)在基礎(chǔ)探討中的應(yīng)用也是很有意義的,它為探討配子和胚胎發(fā)生,細(xì)胞和組織分化,基因表達(dá)調(diào)控,核質(zhì)互作等機(jī)理供應(yīng)了工具。五、克隆技術(shù)存在的問題

盡管克隆技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用前景,但離產(chǎn)業(yè)化尚有很大距離。因?yàn)樽鳛橐粋€(gè)新興的探討領(lǐng)域,克隆技術(shù)在理論和技術(shù)上都還很不成熟,在理論上,分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編(細(xì)胞核內(nèi)全部或大部分基因關(guān)閉,細(xì)胞重新復(fù)原全能性的過程)的機(jī)理還不清晰;克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡,克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因,以及在克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。

在實(shí)踐中,克隆動(dòng)物的勝利率還很低,維爾穆特探討組在培育“多莉“的試驗(yàn)中,融合了277枚移植核的卵細(xì)胞,僅獲得了“多莉”這一只成活羔羊,勝利率只有0.36%,同時(shí)進(jìn)行的胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的克隆試驗(yàn)的勝利率也分別只有1.7%和1.1%,即使是運(yùn)用“檀香山”技術(shù),以分化程度較低的卵丘細(xì)胞為核供體,其勝利率也只有百分之幾。

此外,生出的部分個(gè)體表現(xiàn)誕生理或免疫缺限。以克隆牛為例,日本、法國等國培育的很多克隆牛在降生后兩個(gè)月內(nèi)死去;到2000年2月,日本全國已共有121頭體細(xì)胞克隆牛誕生,但存活的只有64頭。視察結(jié)果表明,部分犢牛胎盤功能不完善,其血液中含氧量及生長因子的濃度都低于正常水平;有些牛犢的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常發(fā)育;克隆動(dòng)物胎兒普遍存在比一般動(dòng)物發(fā)育快的傾向,這些都可能是死亡的緣由。

即使是正常發(fā)育的“多莉”,也被發(fā)覺有早衰跡象。染色體的未端被稱為端粒,它確定著細(xì)胞能夠分裂的次數(shù):每一次分裂端粒都會(huì)縮短,而當(dāng)端粒耗盡后細(xì)胞就失去了分裂實(shí)力。1998年,科學(xué)家發(fā)覺“多莉”的細(xì)胞端粒比正常的要短,即其細(xì)胞處于更蒼老的狀態(tài)。當(dāng)時(shí)認(rèn)為,這可能是用成年綿羊的細(xì)胞克隆“多莉”造成的,使其細(xì)胞具有成年細(xì)胞的印記,但這一說明目前受到了挑戰(zhàn),美國馬薩諸塞州的醫(yī)生羅伯特·蘭扎等用培育的蒼老細(xì)胞克隆牛,得到6頭小牛,誕生5~10個(gè)月后發(fā)覺這些克隆牛的端粒比一般同齡小牛要長,有的甚至比一般新生小牛的端粒還長?,F(xiàn)在還不清晰這一現(xiàn)象的緣由,也不清晰為何與“多莉“的狀況有巨大差別。但這一試驗(yàn)說明,在一些狀況下克隆過程能變更成熟細(xì)胞的分子鐘,使其“復(fù)原青春”,關(guān)于這種變更

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