DB22-T2611-2017-梅花鹿冷凍精液-吉林省

ICS65.020.30DB22B44吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2611—2017梅花鹿冷凍精液Sikadeerfrozensemen吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2611—2017前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊鎰峰、魏海軍、許保增、趙偉剛、趙蒙、陳秀敏、鞠妍、曹新燕、薛海龍、刁云飛、李曉霞、王世勇。IDB22/T2611—2017梅花鹿冷凍精液1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了梅花鹿冷凍精液的規(guī)格、標(biāo)識(shí)、解凍后精子活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、畸形率、菌落數(shù)、包裝、儲(chǔ)存運(yùn)輸。本標(biāo)準(zhǔn)適用于梅花鹿冷凍精液的生產(chǎn)、銷售和使用過(guò)程中精液的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本文件。GB/T2828.11計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序第11部分：小總體聲稱質(zhì)量水平的評(píng)定程序GB/T5458液氮生物容器NY1181輸精細(xì)管下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)progressivemotility4.1細(xì)管1DB22/T2611—20174.1.3容量≥0.18ml。4.2凍融精液4.2.1精子活力≥30%（即0.3）。4.2.2前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥1000萬(wàn)個(gè)/管。4.2.3畸形率≤18%。4.2.4細(xì)菌菌落數(shù)≤100cfu/ml。5抽樣根據(jù)每頭梅花鹿冷凍精液不同的生產(chǎn)批次進(jìn)行抽樣檢測(cè)，抽樣方法應(yīng)符合GB/T2828.11規(guī)定。6試驗(yàn)方法冷凍精液應(yīng)裝在包裝物內(nèi)，保存在液氮罐中，定期檢查罐中液氮的量，并及時(shí)添加液氮以保持包裝物完全浸在液氮中，液氮罐應(yīng)符合GB/T5458的規(guī)定。2DB22/T2611—2017AA附錄A（規(guī)范性附錄）梅花鹿冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)方法A.1解凍A.1.1器材細(xì)管鑷子、恒溫水浴鍋。A.1.2解凍方法從液氮罐中取出細(xì)管凍精，放入到39℃的水浴鍋中，完全融化即可。A.2容量A.2.1器材細(xì)管剪、細(xì)管推針、1.0ml量筒。A.2.2方法解凍方法見(jiàn)A.1.2，用細(xì)管剪剪去封口端，用細(xì)管推針將精液全部注入到1.0ml量筒內(nèi)，讀數(shù)即為每支細(xì)管冷凍精液容量。.................................(A.1)nnQ——細(xì)管凍融精液容量，單位為ml；n——檢測(cè)冷凍精液支數(shù)。3DB22/T2611—2017A.3.1.1器材顯微鏡、精子動(dòng)力分析系統(tǒng)、載玻片、蓋玻片、移液器、槍頭、小試管、試管架。A.3.1.2方法解凍方法見(jiàn)A.1.2，用移液器取充分混勻后的解凍精液(或A.2.1檢測(cè)后的樣品）7μl～10μl置于預(yù)熱好的載玻片上，蓋上蓋玻片后，立即在顯微鏡下觀察（10×或40×物鏡）精子活力，也可使用精子動(dòng)力分析系統(tǒng)觀察活力，分別觀察三個(gè)視野進(jìn)行全面評(píng)定。A.3.1.3計(jì)算三個(gè)視野活力觀察值的平均值按公式（A.2）計(jì)算：+nM=n1+n2..................................(A.2)33式中：M——精子活力，%；nnn1——第一視野精子活力，%；——第二視野精子活力，%；——第三視野精子活力，%。23A.3.2前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)A.3.2.1器材血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、血色素管、顯微鏡或精子動(dòng)力分析系統(tǒng)、計(jì)數(shù)器、小試管、試管架、血蓋片、移液器、槍頭、1.0ml吸管、3%氯化鈉溶液。解凍方法見(jiàn)A.1.2，解凍后精液充分混勻后用血色素管或移液器吸取0.02ml(或A.2.1檢測(cè)后的樣品），緩慢注入到盛有0.98ml的3%氯化鈉溶液的試管內(nèi)，充分混勻，配制成稀釋50倍的精液。用吸管吸取稀釋后精液置于血蓋片邊緣，使精液自行流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿整個(gè)計(jì)數(shù)室，不允許有氣泡，然后在顯微鏡下或精子動(dòng)力分析系統(tǒng)中觀察計(jì)數(shù)。a)每支細(xì)管凍融精液精子數(shù)=5個(gè)方格中精子數(shù)×5（計(jì)數(shù)室內(nèi)25個(gè)中方格中精子數(shù)）×10（1mm內(nèi)精子數(shù)）×1000（每毫升精子數(shù)）×50（稀釋倍數(shù)）×容量3b)每樣品觀察相鄰兩個(gè)計(jì)數(shù)室，取平均值；如兩個(gè)計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)結(jié)果誤差超過(guò)5%，則應(yīng)重新檢測(cè)。c)每支細(xì)管凍融精液中前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)按式（A.3）計(jì)算：c=s×M.....................................(A.3)式中：4DB22/T2611—2017A.3.3.1器材顯微鏡、天平、pH計(jì)、量筒、病理級(jí)載玻片、蓋玻片、血球分類計(jì)數(shù)器、移液器、槍頭、膠頭滴管、雙蒸水、姬姆薩染料、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸鎂、甲醇、甲醛、甘油、棕色試劑瓶。A.3.3.2試劑配制a)碳酸鎂中和甲醛溶液甲醛（40%）MgCO3500ml8.0g完全溶解過(guò)濾后密閉保存于棕色試劑瓶中備用。b)福爾馬林磷酸鹽固定液NaH2PO4·2H2ONa2HPO4·12H2O0.55g2.25g40%甲醛溶液（經(jīng)MgCO3中和）8.0ml加0.89%NaCl溶液30ml，待磷酸鹽充分溶解，用0.89%NaCl溶液定容100ml，靜置24小時(shí)，備用。c)磷酸緩沖液：NaH2PO4·2H2O0.55g2.25gNa2HPO4·12H2O溶于雙蒸水，定容至100ml。d)姬姆薩原液：稱取姬姆薩染料，溶于少量甘油，于研缽內(nèi)研磨至無(wú)顆粒，再將全部甘油倒入，置于56℃恒溫箱中2小時(shí)，然后加入甲醇，過(guò)濾后密閉保存于棕色試劑瓶中備用。e)姬姆薩染液姬姆薩原液、磷酸緩沖液、雙蒸水按體積比2:3:5的比例混合均勻，根據(jù)需要量、現(xiàn)用現(xiàn)配。a)抹片：取10μL混勻后精液，滴于載玻片右端，取另一潔凈、邊緣平滑的載玻片以45°角從左側(cè)接觸精液滴，讓精液沿著蓋玻片底部擴(kuò)散，然后由右向左推動(dòng)載玻片使精液均勻涂抹在載玻片上，載玻片標(biāo)號(hào)，每個(gè)樣品制作三個(gè)抹片。b)風(fēng)干、固定：將制備好的抹片在自然條件下水平放置風(fēng)干5min～20min。將風(fēng)干抹片放平，用膠頭滴管取1.0ml～2.0ml福爾馬林磷酸鹽緩沖固定液緩慢滴在涂片上，固定15min。c)水洗、染色：倒掉固定液，在蒸餾水中沖洗，自然風(fēng)干。將涂片水平放置，用移液器取2.0ml事先配制好的姬姆薩染液滴在涂片上，避免產(chǎn)生氣泡，染色3小時(shí)。d)水洗、鏡檢：倒掉染色液，在蒸餾水中沖洗干凈，自然風(fēng)干后封片。用40～60×物鏡進(jìn)行觀察，每次觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)畸形的精子數(shù)量，取三個(gè)樣片平均值，三個(gè)樣片間差異不能超過(guò)5%，如超過(guò)應(yīng)重新制片。e)精子畸形率按式（A.4）計(jì)算：5DB22/T2611—2017AA=1×100..................................(A.4)S式中：A——精子畸形率，%；A1——畸形精子數(shù)，單位為個(gè)；S——精子總數(shù)，單位為個(gè)。A.4菌落數(shù)檢測(cè)A.4.1器材培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、三角燒瓶、燒杯、量筒、天平、稱量匙、高壓滅菌鍋、微波爐、培養(yǎng)皿、水浴箱、pH計(jì)、牛皮紙、橡皮筋、記號(hào)筆、放大鏡、酵母提取物、胰化蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、1mol/L鹽酸、1mol/L氫氧化鈉，雙蒸水。A.4.2培養(yǎng)基制作酵母提取物胰化蛋白胨氯化鈉5.0g10.0g10.0g用雙蒸水溶解后加瓊脂粉15.0g，微波爐加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6，分裝于三角燒瓶中用牛皮紙密封后高壓滅菌，待溫度下降后在超凈工作臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置使其凝固后，根據(jù)實(shí)際情況標(biāo)注編號(hào)。在超凈工作臺(tái)內(nèi)按照無(wú)菌步驟操作，用移液器吸取解凍混勻后的精液20μl，加注到培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基表面后，用接種針涂抹均勻后，靜置十分鐘后，與對(duì)照培養(yǎng)皿同時(shí)倒置放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)。每支精液涂三個(gè)平皿，培養(yǎng)后分別計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)將平板面對(duì)亮光，用記號(hào)筆在觀察到菌落處做標(biāo)記，并用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)、防止遺漏，必要時(shí)使用放大鏡觀察，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果采用三個(gè)平皿的平均值。B——細(xì)菌菌落數(shù)，單位為cfu/ml；nnn1——第一平皿中菌落數(shù)，單位為cfu/ml；——第二平皿中菌落數(shù)，單位為cfu/ml；——第三平皿中菌落數(shù)，單位為cfu/ml；Q——每劑凍精容量，單位為ml。6DB22/T2611—2017BB附錄B（規(guī)范性附錄）梅花鹿細(xì)管冷凍精液標(biāo)記方法B.1梅花鹿細(xì)管冷凍精液標(biāo)記方法梅花鹿細(xì)管冷凍精液標(biāo)識(shí)由四部分組成，排列順序如下：a)第一部分：種鹿所屬單位。b)第二部分：品種。c)第三部分：生產(chǎn)日期。d)第四部分：種鹿號(hào)。第一、第二部分用漢語(yǔ)拼音大寫首字母表示所屬單位名稱和梅花鹿品種，第三部分凍精生產(chǎn)日期由六位數(shù)按年月日順