2.2.1動物細(xì)胞培養(yǎng)課高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

選擇性必修三《生物技術(shù)與工程》第2章細(xì)胞工程

第2節(jié)動物細(xì)胞工程

（動物細(xì)胞培養(yǎng)）1890年，希普（W.

Heape，1855-1929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。1907年，哈里森（R.

G.Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法。1951年，張明覺（1908-1991）等發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子的獲能現(xiàn)象。1958年，格登（J.Gurdon，1933-）用非洲爪蟾進行體細(xì)胞核移植，成功培育出性成熟個體。同一時期，童弟周（1902-1979）等開展了魚類細(xì)胞核移植工作。1959年試管兔誕生，之后多種試管動物相繼出生。1975年，米爾斯坦（C.Milstein，1927-2002）和科勒（G.

K?hler，1946-1995）等創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)。1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941-）等成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細(xì)胞。1996年，世界上第一只細(xì)胞克隆羊多莉在英國誕生。隨后多種克隆動物相繼問世。2006年，山中伸彌（S.Yamanaka，1962-）等獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。我國科學(xué)家利用這種細(xì)胞培育出了小鼠。2014年，世界上第一個用單細(xì)胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。2017年，我國科學(xué)家首次培育出體細(xì)胞克隆猴。動物細(xì)胞工程（含胚胎工程）從社會中來在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？

可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行培養(yǎng)、擴增。目前，科學(xué)家還在研究對皮膚干細(xì)胞進行培養(yǎng)，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚。人造皮膚：人體再生術(shù)的秘密1、動物細(xì)胞培養(yǎng)（動物細(xì)胞工程基礎(chǔ)）2、動物細(xì)胞融合3、動物細(xì)胞核移植技術(shù)動物細(xì)胞工程的基本技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞核移植1、概念：從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。2、目的：獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物；不能獲得完整動物個體。3、原理：細(xì)胞增殖（有絲分裂）那么，動物細(xì)胞的培養(yǎng)需要哪些條件呢？動物細(xì)胞培養(yǎng)動物體組織單個細(xì)胞細(xì)胞生長和增殖取出分散適宜條件一般取材于動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。細(xì)胞分化程度低，分裂能力強，易培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件思考①直接用合成培養(yǎng)基嗎？為什么？②如何維持無菌、無毒的環(huán)境？③適宜的溫度、pH和滲透壓分別是多少？④氣體環(huán)境？分別有什么作用？裝置？糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境8動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境充足的營養(yǎng)、穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境將細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基含人類未知、細(xì)胞生長增殖所必需的物質(zhì)，滿足細(xì)胞對未知營養(yǎng)成分的需求。培養(yǎng)基的構(gòu)成：合成培養(yǎng)基+血清等天然成分一般用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液9動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境①培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具：滅菌處理；②無菌操作；③適量添加抗生素定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝物。①適宜的溫度：哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以___________為宜；②適宜的pH：多數(shù)動物細(xì)胞生存的適宜pH為________；③適宜的滲透壓：維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能（需要考慮的一個重要環(huán)境參數(shù)）36.5±0.5℃7.2-7.410動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素…無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境維持培養(yǎng)液的pH95%空氣

+5%CO2的CO2培養(yǎng)箱O2：細(xì)胞代謝所必需CO2培養(yǎng)箱松蓋培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿外界的O2可進入瓶內(nèi)，同時使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時排出。閱讀教材P44最后一段+P45正文+圖2-12，構(gòu)建動物細(xì)胞培養(yǎng)的流程圖并思考以下問題：動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程1）選幼齡動物（或胚胎）還是成年動物的組織器官？為什么？2）培養(yǎng)前為什么分散成單個細(xì)胞？3）分散細(xì)胞時為何不選用胃蛋白酶？用胰蛋白酶處理組織時，時間越久效果越好嗎？動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程分瓶取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液取動物組織一般取材于動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。細(xì)胞分化程度低，增殖能力強，容易培養(yǎng)。(1)取材對象:(2)取材原因:1.取動物組織動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程分瓶取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(1)原因：①從動物體取出的成塊組織中，細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖。②利于細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，更易進行物質(zhì)交換。2.分散成單個細(xì)胞（2）怎樣將動物組織分散成單個細(xì)胞？機械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間。蛋白質(zhì)不可以，因為胃蛋白酶的最適PH為1.5左右長時間會分解細(xì)胞膜蛋白，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，注意控制時間和酶用量。①說明動物細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？②用胃蛋白酶可以嗎？③胰蛋白酶處理時間過長，會怎樣？動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程分瓶取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)3.制成細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于適宜環(huán)境中進行原代培養(yǎng)。制成細(xì)胞懸液取動物組織放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程分瓶取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)4.原代培養(yǎng):指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。(1)概念：懸浮生長貼壁生長(大多數(shù)）細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等接觸抑制能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖需要貼附于某些基質(zhì)表面才能生長增殖這類細(xì)胞往往貼附在培養(yǎng)瓶的瓶壁上?！?xì)胞貼壁要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞通常會停止分裂增殖。解決辦法?動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程思考：“細(xì)胞增殖到互相接觸的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖，出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象”試結(jié)合上述解釋，舉例說明哪種細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，并闡述原因。癌細(xì)胞；癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上糖蛋白等物質(zhì)減少腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制，條件適宜在培養(yǎng)液可以無限增殖下去。動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程分瓶取動物組織分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)5.分瓶、傳代培養(yǎng)（1）收集細(xì)胞②貼壁生長類：重新用胰蛋白酶等處理,使之分散成單個細(xì)胞，然后再用離心法收集。（2）將收集的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)動物細(xì)胞的整個培養(yǎng)過程中可能多次用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶：第一次使用的目的是使組織細(xì)胞分散開；貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)時使用的目的是使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，分散成單個細(xì)胞，便于分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)。直接用離心法收集①懸浮生長類：判斷依據(jù)：是否分瓶！分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程前者，這些個體的細(xì)胞分化程度低、分裂能力強，易培養(yǎng)。3）分散細(xì)胞時為何不選用胃蛋白酶？用胰蛋白酶處理組織時，時間越久效果越好嗎？2）培養(yǎng)前為什么分散成單個細(xì)胞？①成塊組織中，細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖。分散不會限制彼此的生長與增殖；②分散有利于與培養(yǎng)液充分接觸，保證O2與營養(yǎng)供應(yīng)和代謝物及時排出。多數(shù)動物細(xì)胞生存的適宜pH為7.2～7.4，而胃蛋白酶的適宜pH約為2，在此環(huán)境中會失活；細(xì)胞膜含有蛋白質(zhì)，長時間處理會損傷細(xì)胞，要控制好時間。1）選幼齡動物（或胚胎）還是成年動物的組織器官？為什么？思考●討論2：植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較

P42比較項目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分過程結(jié)果相同點固體培養(yǎng)基葡萄糖、動物血清液體培養(yǎng)基細(xì)胞增殖植物細(xì)胞的全能性許多細(xì)胞蔗糖、植物激素①都進行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂；②均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件新的植株外植體↓脫分化愈傷組織

↓再分化芽、根或胚狀體↓生長發(fā)育植物體動物的組織

↓機械法或胰蛋白酶、

↓膠原蛋白酶處理細(xì)胞懸液↓原代培養(yǎng)↓細(xì)胞懸液↓傳代培養(yǎng)×其原理是細(xì)胞增殖，未體現(xiàn)全能性；×√×原代培養(yǎng)指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)，不一定是第一次細(xì)胞增殖。單層細(xì)胞;針對訓(xùn)練(1)動物細(xì)胞培養(yǎng)體現(xiàn)了動物細(xì)胞的全能性()(2)培養(yǎng)保留接觸抑制的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶壁上可形成多層細(xì)胞()(3)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞直接用離心法收集，貼壁細(xì)胞需要用胰蛋白酶等

處理后再用離心法收集()(4)培養(yǎng)動物細(xì)胞的第一代(即第一次細(xì)胞增殖)被稱為原代培養(yǎng)()√加入血漿需要加入氧氣，呼吸針對訓(xùn)練1.一般來說，動物細(xì)胞體外培養(yǎng)需要滿足以下條件①無毒的環(huán)境②無菌的環(huán)境③只使用合成培養(yǎng)基④溫度與動物的體溫相近⑤因在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，故不需要O2

⑥多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)在7.2～7.4的pH環(huán)境A.①②④⑤⑥ B.①②③④C.①②③⑤⑥ D.①②④⑥2．從小鼠胚胎中分離獲取胚胎成纖維細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)，在傳代后的不同時間點檢測細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果如圖。下列敘述正確的是()D應(yīng)將培養(yǎng)皿至于95%空氣＋5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中，而非密封，×;①的細(xì)胞還未快速增長，此時進行傳代培養(yǎng)沒有意義，應(yīng)選②，×;對于貼壁生長的細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)時，先需要用胰蛋白酶等處理，×;針對訓(xùn)練A．傳代培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿需密封防止污染B．選?、俚募?xì)胞進行傳代培養(yǎng)比②更合理C．直接用離心法收集細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)D．細(xì)胞增長進入平臺期可能與細(xì)胞密度過大有關(guān)干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用閱讀教材P46，回答下列問題：1.什么是干細(xì)胞？它有哪些類型？這些類型的干細(xì)胞各有怎樣的特點和哪些方面的應(yīng)用？2.科學(xué)家是怎樣獲得iPS細(xì)胞的？這種細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相比，有哪些應(yīng)用優(yōu)勢？3.干細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療可能存在什么問題？4.你如何看待干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用所產(chǎn)生的效益與風(fēng)險？成人干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1.概念受精卵原始胚胎干細(xì)胞囊胚胎兒胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞。在一定條件下，干細(xì)胞可以分化成其他類型的細(xì)胞。存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血。干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用2.分類（1）胚胎干細(xì)胞（簡稱ES細(xì)胞）?分布：?特點：?應(yīng)用實例：?局限性：存在于

中具有分化為成年動物體內(nèi)的

類型的細(xì)胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至

的潛能。目前科學(xué)家已分離出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES細(xì)胞，在體外培養(yǎng)可分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和造血干細(xì)胞等細(xì)胞。必須從

中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。早期胚胎任何一種個體胚胎有著自我更新能力

及分化潛能的干細(xì)胞，與組織、器官的

、

和

等密切相關(guān)。干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（2）成體干細(xì)胞?分布：?特點?常見類型存在于

組織或器官內(nèi)的干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞精原干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)最早研究最多應(yīng)用最成熟具有

性，只能分化成

細(xì)胞或組織，

發(fā)育成完整個體的能力。成體（骨髓、外周血和臍帶血中）（神經(jīng)系統(tǒng)中）（睪丸中）組織特異特定的不具有?作用：發(fā)育再生修復(fù)2.分類治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕?、阿爾茨海默病等）造血干細(xì)胞→神經(jīng)干細(xì)胞→治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病。干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用?概念：通過

誘導(dǎo)小鼠

細(xì)胞，獲得了類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞?誘導(dǎo)方法：①借助載體將

或

導(dǎo)入細(xì)胞（成纖維細(xì)胞以及已分化

的

均可）；②用

誘導(dǎo)形成。?誘導(dǎo)多能干細(xì)胞優(yōu)點：①誘導(dǎo)過程

破壞胚胎；②

iPS

細(xì)胞可以來源于病人自身的

細(xì)胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免

反應(yīng)。體外成纖維（簡稱iPS細(xì)胞）特定基因特定蛋白T細(xì)胞、B細(xì)胞小分子化合物無須體免疫排斥（3）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞2.分類所以，科學(xué)家普遍認(rèn)為iPS細(xì)胞的應(yīng)用前景優(yōu)于胚胎干細(xì)胞。干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用干細(xì)胞將在再生醫(yī)學(xué)、藥物安全性與有效性檢測等領(lǐng)域發(fā)揮大作用。面臨的問題：存在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險。應(yīng)用展望：3.面臨的問題及展望三種干細(xì)胞的比較

來源或存在功能、特點局限性胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)成體干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)早期胚胎能夠分化成為動物體內(nèi)的任何細(xì)胞，并進一步形成組織、器官甚至生物個體成體組織或器官，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和精原干細(xì)胞等體外誘導(dǎo)體細(xì)胞產(chǎn)生能分化成為具有特定功能的細(xì)胞來治療疾病。無須破壞胚胎，且避免免疫排斥反應(yīng)。具有組織特異性，能分化成特定的細(xì)胞或組織不具有發(fā)育成完整個體的能力需從胚胎中獲取，涉及倫理問題，限制了它在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用技術(shù)不成熟。無菌、無毒營養(yǎng)溫度、pH和滲透壓氣體環(huán)境制備細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程干細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用干細(xì)胞的種類、特點及應(yīng)用iPS細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用課堂小結(jié)1.判斷下列有關(guān)動物細(xì)胞培養(yǎng)的表述是否正確。（1）培養(yǎng)環(huán)境中需要O2，不需要CO2。（

）（2）細(xì)胞要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。（

）（3）培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨