血液分析儀檢測原理及散點圖直方圖

血液分析儀檢測原理及散點圖直方圖匯報人：XXX202505101主要內(nèi)容一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用三

散點圖四

直方圖2

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

血液分析儀檢測原理主要分為兩類：電學(xué)和光（化）學(xué)，用于測定血液中的細胞和細胞內(nèi)容物。

（一）電學(xué)檢測原理及技術(shù)1電阻抗法

2射頻電導(dǎo)法

（二）光（化）學(xué)檢測原理及技術(shù)

1激光散射法

2分光光度法

3

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

（一）電學(xué)檢測原理及技術(shù)1電阻抗法

儀器小孔管有內(nèi)外兩個電極。當(dāng)注入等滲緩沖液并加載低頻直流電后，內(nèi)、外電極與緩沖液即構(gòu)成電流回路。

當(dāng)細胞懸液流經(jīng)寶石計數(shù)小孔時，由于血細胞具有相對非導(dǎo)電的特性，使電路中小孔感應(yīng)區(qū)內(nèi)的電阻突然增大，引起瞬間電壓變化而形成脈沖信號。

脈沖信號的強弱反映細胞體積的大小，脈沖信號的多少反映細胞的數(shù)量。這些信號經(jīng)過放大、閾值調(diào)節(jié)、甄別、整形、計數(shù)及自動控制保護系統(tǒng)，完成對血細胞的計數(shù)和體積測定。三分類血液分析多采用電阻抗法。

電阻抗法細胞計數(shù)原理圖4

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

（一）電學(xué)檢測原理及技術(shù)2射頻電導(dǎo)法

射頻（radiofrequency,RF）指射頻電流，是每秒變化＞10000次的高頻交流電磁波。

高頻電流能通過細胞膜，由于不同細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，電導(dǎo)性也不同，因此用高頻電磁探針檢測細胞的電導(dǎo)性，利用細胞內(nèi)部化學(xué)成分、胞核和胞質(zhì)（核質(zhì)比）、顆粒成分（大小、密度）等特征性信息進行細胞分類。

電導(dǎo)性有助于鑒別體積相同、但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細胞（或相似體積的顆粒）；如淋巴細胞和嗜堿性粒細胞的直徑雖均為9～12μm,但在高頻電流檢測時，因兩類細胞核質(zhì)比例不同而出現(xiàn)不同的檢測信號。

射頻電流檢測原理5

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

（二）光（化）學(xué)檢測原理及技術(shù)

1激光散射法

（1）原理：光散射是指光在透明介質(zhì)中傳播時，有部分光波偏離原有方向而向四周傳播的現(xiàn)象。經(jīng)稀釋、染色等處理后的細胞懸液注入鞘液流中央，細胞沿著懸液和鞘液流兩股液流整齊單個排列，以恒定流速定向通過檢測區(qū)。

細胞在檢測區(qū)被激光束照射時，因其自身的特性（如體積、染色程度、細胞內(nèi)容物大小及多少、細胞核密度等）可阻擋或改變光束的方向，產(chǎn)生與其特征相應(yīng)的各種角度的散射光（表1），并被信號檢測器接收。

鞘流技術(shù)1檢測光；2細胞流；3前鞘流；4后鞘流；5液流方向。67散射光意義低角度散射光（前向散射光，F(xiàn)SC）反映細胞（或顆粒）的數(shù)量和表面體積。細胞越大，F(xiàn)SC的信號就越強。高角度散射光（側(cè)向散射光，SSC）反映細胞內(nèi)部顆粒、細胞核等復(fù)雜性。細胞內(nèi)部構(gòu)造越復(fù)雜，SSC的信號越強。如嗜酸性粒細胞由于內(nèi)部顆粒特征明顯，其側(cè)向散射光（SSC）信號最強，落在散點圖的最右方。側(cè)向熒光（SFL）反映了核酸的含量的多少，提示細胞發(fā)育的成熟程度。表1各種角度的散射光及其意義

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

（二）光（化）學(xué)檢測原理及技術(shù)

1激光散射法

（2）應(yīng)用：散射光技術(shù)可檢測染色后的細胞，不同種類的細胞被染料著色的強弱程度不同，產(chǎn)生的散射熒光及散射光變化也不同，因此可準確區(qū)分正常類型的細胞（或顆粒）。染料包括熒光染料和非熒光染料（見表2）。

流式細胞術(shù)檢測通道和光路系統(tǒng)8表2染料的種類及應(yīng)用類別種類應(yīng)用熒光染料主要有堿性槐黃、噻唑橙、惡嗪、碘化丙啶、聚亞甲基藍等。主要用于核酸染色，熒光染色后的細胞（或顆粒）經(jīng)激光照射后可產(chǎn)生特定波長的散射熒光。非熒光染料主要有亞甲基藍（用于核酸染色）、氯唑黑、過氧化物酶等。細胞被染色，部分發(fā)生光吸收現(xiàn)象，使散射光強度發(fā)生變化。9

一

血液分析儀檢測原理及技術(shù)

（二）光（化）學(xué)檢測原理及技術(shù)2分光光度法：主要用于血紅蛋白測定，檢測原理同手工分光光度儀比色法的血紅蛋白檢測，遵循Lamber～Beer定律。

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二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

（二）紅細胞計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

（三）血小板計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

（四）網(wǎng)織紅細胞及相關(guān)參數(shù)檢測

（五）有核紅細胞計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

11

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

1激光與細胞化學(xué)法

2體積、電導(dǎo)、光散射法

3電阻抗與射頻法

4多角度偏振光散射法12

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

1激光與細胞化學(xué)法

應(yīng)用激光散射和過氧化物酶染色技術(shù)進行白細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù)。

（1）過氧化物酶染色通道：在白細胞通道加入溶血劑和POX染色劑，白細胞POX活性由大到小的依次為：嗜酸性粒細胞＞中性粒細胞＞單核細胞；淋巴細胞和嗜堿性粒細胞無POX活性?？捎嬎氵^氧化物酶平均指數(shù)（MPXI)，得到嗜酸性粒細胞、中性粒細胞或單核細胞的相對POX活性。形成以POX分布強度為X軸、以細胞體積為Y軸的散點圖，進行白細胞計數(shù)與分類。

白細胞（NLME）POX染色散點圖POX活性FSC13

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

1激光與細胞化學(xué)法

（2）

嗜堿性粒細胞/核分葉性通道：苯二酸完全破壞紅細胞和血小板；除嗜堿性粒細胞外，其他白細胞膜溶解，胞質(zhì)溢出，僅剩祼核。完整的嗜堿性粒細胞呈高角度散射，位于散點圖上部；祼核則位于下部，可進行白細胞計數(shù)和嗜堿粒計數(shù)。

（3）

未染色大細胞計數(shù)（LUC）檢測：在POX通道，可檢測到無POX活性，體積大于正常淋巴細胞體積平均值2個標準差的細胞，如異淋、漿細胞、幼淋及原始細胞。嗜堿性粒細胞/核分葉性散點圖14

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

2體積、電導(dǎo)、光散射法

體積、電導(dǎo)、光散射法：即VCS技術(shù)，包括應(yīng)用電阻抗原理測量細胞體積（volume，V）,應(yīng)用電導(dǎo)性（conductivity，C）測量細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及接收每一個細胞經(jīng)激光源照射后產(chǎn)生的不同角度的光散射（scatter，S）技術(shù)。15

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

3電阻抗與射頻法（sysmexXN～1000）

（1）4DIFF通道（WDF通道）：利用半導(dǎo)體激光流式細胞術(shù)、核酸熒光染色技術(shù)。采用溶血劑完全溶解紅細胞和血小板，白細胞膜僅部分溶解。聚亞甲基藍核酸熒光染料進入白細胞內(nèi)，使DNA、RNA和細胞器著色。因熒光強度與細胞內(nèi)核酸含量成比例，所以未成熟粒細胞、異常細胞熒光染色深，成熟白細胞熒光染色淺，從而得到4DIFF白細胞散點圖。

白細胞分類—4DIFF散點圖EoNML16

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

3電阻抗與射頻法（sysmexXN～1000）

（2）白細胞/嗜堿性粒細胞通道（WNR通道）：在堿性溶血劑作用下，除嗜堿粒細胞外的其他所有細胞均被溶解或萎縮，經(jīng)流式細胞術(shù)計數(shù)，可得到白細胞/嗜堿性粒細胞百分率和絕對值及及WBC/BASO散點圖。

白細胞分類—WBC/BASO散點圖WBCB17

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

3電阻抗與射頻法

（3）未成熟髓細胞信息（IMI）通道：采用射頻、電阻抗和特殊試劑結(jié)合法。在細胞懸液中加入硫化氨基酸，幼稚細胞膜脂質(zhì)含量高，結(jié)合硫化氨基酸的量多于較成熟的細胞，對溶血劑有抵抗作用。加入溶血劑后，成熟細胞被溶解，只留下幼稚細胞（包括造血祖細胞、原始細胞、未成熟細胞、有核紅細胞）和異型/異常淋巴細胞，報告百分率和絕對值，并提示核左移。

未成熟粒細胞信息通道散點圖18

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

4多角度偏振光散射法

（1）多角度偏振光散射法：應(yīng)用氮氖激光流式細胞術(shù)，分四個角度檢測。

①0度：反映細胞大小、檢測細胞數(shù)量。②7度：反映細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及核染色質(zhì)的復(fù)雜性。③90度偏振光：反映細胞內(nèi)部顆粒及細胞核分葉情況。④90度去偏振光：“去偏振”是指垂直方向的的激光光波運動隨光散射結(jié)果而改變。嗜酸性粒細胞顆粒豐富，可消除偏振光，以與中性粒細胞相鑒別。19

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（一）白細胞五分類計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測

4多角度偏振光散射法

（2）染料：鞘液中的DNA染料碘化丙啶可破壞有核紅細胞膜，只留下裸核而將其染色。染料對有活性的白細胞只有極小滲透性或無滲透性，故其細胞核不染色。通過多散點圖分析（MSA），可鑒別有核紅細胞、無活性白細胞和脆性白細胞，計算活性白細胞比率和計數(shù)有核紅細胞。20

二

不同儀器檢測原理的綜合應(yīng)用

（二）紅細胞計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測：分別組合應(yīng)用電阻法、流式細胞術(shù)-光散射-電阻抗法、流式細胞術(shù)-光散射法。

（三）血小板計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測：分別組合應(yīng)用電阻抗法、流式細胞光散射-核酸熒光染色-電阻抗法、流式細胞術(shù)-光散射法等。

（四）網(wǎng)織紅細胞及相關(guān)參數(shù)檢測：應(yīng)用非熒光或熒光RNA染色光散射法。

（五）有核紅細胞計數(shù)及相關(guān)參數(shù)檢測：應(yīng)用VCS法、流式細胞DNA熒光染色光散射法等。

21

三

散點圖識別

散點圖上的每個點代表被測定的一個細胞或某種顆粒，此點的橫坐標和縱坐標分別代表細胞或某種顆粒的兩項特性。由于各種細胞的理化性質(zhì)不同，具有特征性的細胞或某種顆粒在坐標上點的位置也不同，如用不同顏色的點代表各類細胞或某種顆粒，則在散點圖上可見不同區(qū)域彩色散點圖，從而加以區(qū)分。

各種五分類血液分析儀均采用激光散射法和散點圖來表達測定的結(jié)果，不同型號的儀器因檢測原理組合不同，散點圖表達形式也有顯著差別。sysmexXN～1000型血液分析儀主要有WNR散點圖和WNR散點圖。22

三

散點圖識別（一）WDF散點圖

進行白細胞的計數(shù)，分類為淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞，并提示異常/幼稚細胞的檢出。通過溶血劑破壞紅細胞，白細胞胞膜輕微受損，利用SSC獲得不同白細胞內(nèi)部構(gòu)造復(fù)雜程度的差異；通過熒光染色，利用SFL獲得不同白細胞核酸及細胞器種類和多少的差異，從而對各類白細胞進行區(qū)別計數(shù)。注：Debris：影細胞/細胞碎片；LYMPH：淋巴細胞；AbnormallymphBlast：異常淋巴細胞/原幼淋巴細胞；Atypicallymph：不典型淋巴細胞/異型淋巴細胞；Leftshift：核左移；IG：未成熟粒細胞（包括桿、早、中、晚）。SSC側(cè)向散射光SFL側(cè)向熒光WDF通道散點圖23

三

散點圖識別（二）WNR散點圖

進行白細胞的計數(shù)、嗜堿性粒細胞和有核紅細胞的分類計數(shù)。

通過溶血劑破壞紅細胞，白細胞胞膜輕微受損，利用FSC獲得白細胞形態(tài)差異，將嗜堿性粒細胞區(qū)別于其他白細胞進行計數(shù)；通過熒光染色，利用SFL檢出有核紅細胞并進行計數(shù)。注:Debris：影細胞/細胞碎片；PLTClumps：血小板凝集；WBC：除外BASO的其他白細胞；NRBC：有核紅細胞；BASO：嗜堿性粒細胞。SFL側(cè)向熒光FSC前向散射光圖12WNR通道散點圖24

四

直方圖

儀器采用電阻法計數(shù)細胞數(shù)量的同時，能提供細胞體積分布圖形，橫坐標為血細胞體積大小，縱坐標為不同體積細胞的相對頻率，這些用以表示細胞群體分布情況的曲線圖形，稱作細胞直方圖。25

四

直方圖

1直方圖的觀察要點2白細胞直方圖

3紅細胞直方圖4血小板直方圖26

四

直方圖1直方圖的觀察要點：①

峰的位置反映主細胞群體積；②

峰的高度反映主細胞群數(shù)量；③

峰底寬度反映主細胞群體積均一性；④

峰的頭尾處異常提示干擾因素；⑤

異常峰提示異常細胞群。27

四

直方圖2白細胞直方圖

在35～450fl范圍內(nèi)將血細胞分為3群。正常白細胞直方圖左側(cè)峰又高又陡，跨越35～95fl，定為淋巴細胞峰（小細胞群），以成熟小淋巴細胞為主；最右側(cè)峰又低又寬，跨越160～450fl，定義為中性粒細胞峰（大細胞群），以中性粒細胞為主，包含桿狀粒細胞和晚幼粒細胞；左右兩峰之間的谷平坦區(qū)，定為單個細胞峰（中間細胞群），主要以單核細胞為主，也含有嗜酸、嗜堿性粒細胞及白血病細胞等。白細胞異常直方圖信號的含義見表3。28表3白細胞異常直方圖信號的含義符號異常區(qū)域可能原因R1淋巴細胞峰左側(cè)有血小板聚集、巨大血小板、有核紅紅胞、未溶解紅細胞、白細胞碎片、蛋白質(zhì)或脂類顆粒R2淋巴細胞峰與單個核細胞峰之間有異淋、漿細胞、非典型細胞、原始細胞、嗜酸性粒細胞增多、嗜堿性粒細胞增多R3單個核細胞區(qū)與中性粒細胞峰之間有未成熟的中性粒細胞、異常細胞亞群、嗜酸性粒細胞增多、嗜堿性粒細胞增多R4中性粒細胞峰右側(cè)中性粒細胞絕對值增多RM出現(xiàn)多部位警報同時存在2種或2種以上的異常29

四

直方圖3紅細胞直方圖

儀器在36～360fL范圍內(nèi)分析紅細胞。正常紅細胞，主要分布在50～200fL范圍內(nèi)，可見兩個細胞群體。從50～125fL區(qū)域有一個幾乎兩側(cè)對稱、較狹窄的正態(tài)分布曲線；主峰右側(cè)在125～200fL區(qū)域的細胞，為大紅細胞和網(wǎng)織紅細胞。紅細胞體積大小發(fā)生變化，峰可左移或右移，或出現(xiàn)雙峰。MCV：90.2fl（正常范圍82～96fl）RDW～SD:45.1fl（正常范圍37～50fl）RDW～CV:13.9%（正常范圍11.5～15.5%）30

四

直方圖3紅細胞直方圖RDW～SD與RDW～CV