DB22-T2083-2014-食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAMP法-吉林省

ICS65.020B61DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2083—2014食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAMP法Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2083—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省農(nóng)業(yè)委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋慧、劉曉龍、金周雨、湯海峰、宗立立、李雨婷、王健、譚旭華、李艷麗。IDB22/T2083—2014食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAMP法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用RAMP技術(shù)鑒定食用菌菌種真實(shí)性的分析步驟、結(jié)果記錄、分析鑒定的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于猴頭菌（Hericiumerinaceus）、小刺猴頭菌（Hericiumcaput-medusae）、珊瑚狀猴頭菌（HericiumcoralloidesPers）、黑木耳（Auriculariaauricular）和光帽鱗傘（Pholiotanameko）食用菌菌種真實(shí)性的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T12728食用菌術(shù)語3.1隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism（RAMP）是以1條與微衛(wèi)星序列互補(bǔ)的SSR引物和1條RAPD隨機(jī)引物相組合，對基因組中的微衛(wèi)星序列與隨機(jī)引物互補(bǔ)序列之間的DNA片段進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增的技術(shù)。3.2供檢菌種與對照菌種的符合性采用RAMP標(biāo)記擴(kuò)增基因組中微衛(wèi)星序列與隨機(jī)引物互補(bǔ)序列之間的DNA片段，通過比較試樣與對照指紋圖譜，從而對菌種進(jìn)行鑒定。5儀器設(shè)備及試劑見附錄A。6溶液配制1DB22/T2083—2014見附錄B。7分析步驟7.1菌絲培養(yǎng)7.1.1培養(yǎng)基的制備稱取去皮馬鈴薯200.0g，制備成均勻碎塊（約1cm），加蒸餾水1000mL，煮沸30min，濾除固體3殘?jiān)隈R鈴薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀0.46g，磷酸氫二鉀1.0g，瓊脂18.0g，加熱使其充分溶解，定容至1000mL，pH自然，裝入試管，塞好試管塞。121℃-126℃，高壓滅菌30min，擺成斜面冷卻后使用。7.1.2接種將供檢菌株與對照菌株在相同條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)量可供做3個(gè)平行鑒定試驗(yàn)。將待供檢菌株與對照菌株在無菌條件下，切?。?～5）mm×（3～5）mm大小一塊母種，迅速轉(zhuǎn)移至試管斜面培養(yǎng)基中央位置，每個(gè)菌株接種20支～30支試管。7.1.3恒溫培養(yǎng)將接種后的試管置恒溫培養(yǎng)箱中，分別在25℃條件下避光培養(yǎng)黑木耳9d～12d，猴頭菌、小刺猴頭菌、珊瑚狀猴頭菌培養(yǎng)12d～15d；在20℃條件下避光培養(yǎng)光帽鱗傘15d～20d。7.2.1稱取0.1g的菌絲置于無菌研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；7.2.2將菌絲粉末迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL的65℃預(yù)熱的CTABDNA提取緩沖液，置于65℃水浴45～60min，每5min～15min顛倒混勻；7.2.3加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)抽提10min，顛倒混勻，4℃，12000rpm離心5min；7.2.4取上清加等體積氯仿-異戊醇（24:1）抽提10min，顛倒混勻，4℃，12000rpm離心5min，重復(fù)7.2.4抽提1次；7.2.5加等體積異丙醇-20℃充分沉淀；7.2.7加500μL的70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥，加40μL的TE緩沖液（pH8.0）溶解；7.2.8加入10mg/mL的RNase溶液至終濃度達(dá)50μg/mL，去除RNA，37℃水浴1h；7.2.9重復(fù)操作7.2.3～7.2.5，加入100μLTE緩沖液（pH8.0），使DNA充分溶解，并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆萌?%瓊脂糖溶液40mL加入4μL的溴化乙錠，緩慢倒入凝膠托盤中冷卻，避免出現(xiàn)氣泡，插入梳子，待膠體凝固后，緩慢拔出梳子，將凝膠托盤置于裝有1×TAE緩沖液的水平電泳槽中；在凝膠點(diǎn)樣孔中加入5μL菌株DNA提取液與2μL的6×Loadingbuffer的混合液體，用5μL的λHindⅢMarker作為參照；采用100V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)前沿指示劑移動到距凝膠前沿0.5cm～1cm處，停止電泳2DB22/T2083—2014（約1h）；在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相；電泳條帶應(yīng)呈現(xiàn)單一清晰狀態(tài)，否則重新提取DNA。7.3.2紫外檢測取3μLDNA提取液，用無菌水稀釋至一定倍數(shù)，混勻后，加入石英比色皿中，加入量為比色皿體積的3/4，并以無菌水或TE緩沖液為空白對照，用紫外-可見分光光度計(jì)分別在260nm和280nm下測量其OD值，計(jì)算OD260/OD280比值，如果該比值在1.6~1.8之間，可以進(jìn)行PCR反應(yīng)，否則重新提取DNA。待測樣品含量（μg/mL）=OD260值×稀釋倍數(shù)×507.4PCR擴(kuò)增7.4.1RAMP引物及其使用由4條SSR引物和10條RAPD引物組成40對核心引物。使用時(shí)首先選用5對參見附錄C（按菌種分類引物）。如果沒有得到好的結(jié)果，則選用其他組合。7.4.2PCR反應(yīng)體系25μL的反應(yīng)體積，含ddH2O為3.25μL，10×PCR緩沖液為2.50μL，2.5mmol/LdNTPs為2.00μL，10μmol/LPrimer1為1.00μL，10μmol/LPrimer2為1.00μL，5U/μLTaqDNA聚合酶為0.25μL，5ng/μLDNA模板為15.00μL。設(shè)置空白對照。94℃預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。參見7.3.1方法。配制2%瓊脂糖凝膠，在點(diǎn)樣孔中加入5μL的菌株P(guān)CR產(chǎn)物與2μL的6×Loadingbuffer的混合液體，取DL2000Marker和150bpMarker各3μL混合后作為參照。供檢菌株與對照菌株差異明顯，判定供檢菌株與對照菌株不屬于同一菌種或同一品種，如只出現(xiàn)一對引物差異，則判定為近似菌種或近似品種。供檢菌株與對照菌株之間的譜帶未檢測出差異，再選定5個(gè)引物做進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)。必要時(shí)可增加其他方法佐證。3DB22/T2083—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備A.1.1PCR擴(kuò)增儀；A.1.2紫外-可見分光光度計(jì)；A.1.3凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀；A.1.4冷凍離心機(jī)（能離心0.2～1.5mL離心管，轉(zhuǎn)速在1×10rpm以上）；4A.1.5高壓滅菌裝置（可以達(dá)到溫度121.3℃，壓力0.15MPa）；A.1.6超凈工作臺；A.1.7分析天平（感量0.0001g）；A.1.8微量移液器：規(guī)格分別為10mL、20mL、100mL、200mL、1000mL，連續(xù)可調(diào)；A.1.9酸度計(jì)；A.1.10恒溫培養(yǎng)箱；A.1.11冰箱：最低溫度-20℃；4DB22/T2083—2014A.2.18DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：DL2000；A.2.19核酸染色劑；按說明使用。（警告——使用本試劑的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室的工作經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。）A.2.20甲叉雙丙烯酰胺（bisacrylamide）；A.2.21丙烯酰胺（acrylamide）；A.2.22無水乙醇；A.2.23四甲基乙二胺（TEMED）；A.2.24過硫酸銨（APS）；A.2.25冰醋酸；A.2.26DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5DB22/T2083—2014BB附錄B（規(guī)范性附錄）試劑的配制除另有說明外，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682規(guī)定的一級水。B.1溴酚藍(lán)前沿指示劑加1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解（溴酚藍(lán)其鈉鹽易溶解在水里）。B.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液稱取Tris121.1g，加去離子水溶解，冷卻至室溫后用濃HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0(約42mL)，定容至1000mL，高壓滅菌。B.310mol/L氫氧化鈉溶液稱取二水乙二胺四乙酸二鈉186.1g，加去離子水700mL完全溶解（加熱）后，冷卻至室溫，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8.0，加去離子水定容至1000mL，高壓滅菌。1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)4mL，5mol/LNaCl56mL,1-2gCTAB，1gPVP-40，65℃水浴溶解，定容至100mL，高壓滅菌。使用前加入0.1%的β-巰基乙醇。量取1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液10mL和0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液2mL，加水定容至1000mL，分裝高壓滅菌。稱取Tris242.2g，量取冰醋酸57.2mL，加水溶解后，再加入0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液100mL，加水定容至1000mL。使用時(shí)稀釋50倍。6DB22/T2083—2014稱取0.4g瓊脂糖于三角瓶中，加入40mL的1×TAE緩沖液，微波爐加熱溶解。B.970%乙醇溶液取70mL無水乙醇，加水定容至100mL。7DB22/T2083—2014CC附錄C（資料性附錄）分析用DNA引物參照引物對表中相對應(yīng)的核心引物對（一）為首選引物。表C.1黑木耳核心引物對（一）編號類型核苷酸序列編號類型核苷酸序列I2I3I4I4I4SSRSSRSSRSSRSSR5'-GTTGTGTGTG-3'5'-GTCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'S8S8S1S5S8RAPDRAPDRAPDRAPDRAPD5'-GTCCACACGG-3'5'-GTCCACACGG-3'5'-GTGACATGCC-3'5'-ACGCACAACC-3'5'-GTCCACACGG-3'表C.2黑木耳核心引物對（二）類型核苷酸序列類型核苷酸序列類型核苷酸序列類型核苷酸序列8DB22/T2083—2014表C.4光帽鱗傘核心引物對（二）編號類型核苷酸序列編號類型核苷酸序列I1I2I3I3I3I4I4I4I4I4SSRSSRSSRSSRSSRSSRSSRSSRSSRSSR5'-GCTGTGTGTG-3'5'-GTTGTGTGTG-3'5'-GTCACACACA-3'5'-GTCACACACA-3'5'-GTCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'S9S10S3RAPDRAPDRAPDRAPDRAPDRAPDRAPDRAPDRAPDRAPD5'-CTGCTGGGAC-3'5'-AGATGCAGCC-3'5'-GGTGACGCAG-3'5'-CCAGATGCAC-3'5'-GTCCACACGG-3'5'-TTGGCACGGG-3'5'-GTCGCCGTCA-3'5'-CAGCACCCAC-3'5'-CTGCTGGGAC-3'5'-AGATGCAGCC-3'S7S8S2S4S6S9S10表C.5猴頭菌屬核心引物對（一）類型核苷酸序列核苷酸序列I1I1I2I3I4SSRSSRSSRSSRSSR5'-GCTGTGTGTG-3'5'-GCTGTGTGTG-3'5'-GTTGTGTGTG-3'5'-GTCACACACA-3'5'-GCCACACACA-3'S6S8S6S6S8RAPDRAPDRAPDRAPDRAPD5'-CAGCACCCAC-3'5'-GTCCACACGG-3'5'-CAGCACCCAC-3'5'-CAGCACCCAC-3'5'-GTCCACACGG-3'類型核苷酸序列核苷酸序列9DB22/T2083—2014表C.7分析用SSR和RAPD引物編號類型核苷酸序列I1I2I3I4S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10SSRSSR5'-GCTGTGTGTG-