DB22-T2079-2014-皮革中動物源性成分檢測實時熒光PCR法-吉林省

ICS59.140.20B45DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2079—2014皮革中動物源性成分檢測實時熒光PCR法Detectionofanimal-derivedingredientsinleatherbyrealtimePCRmethod吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2079—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國延邊出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉金華，聶丹丹，劉韜，王瑋琳，劉陽，吳連鵬，王寧，羅雁菲。IDB22/T2079—2014皮革中動物源性成分檢測實時熒光PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了天然皮革中動物源性成分的定性檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于天然皮革牛、羊、豬成分的定性PCR檢測，不適用于再生革、人造革和合成革。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3原理利用實時熒光PCR技術(shù)，根據(jù)不同物種的特異性基因序列對牛、羊、豬源性成分進(jìn)行鑒定。利用CTAB裂解液破碎細(xì)胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA為模板進(jìn)行實時熒光PCR檢測；通過特異性引物和標(biāo)記熒光物質(zhì)探針進(jìn)行牛、羊、豬源性成分的實時熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的擴(kuò)增曲線判定，實現(xiàn)對皮革中牛、羊、豬源性成分的定性分析。4.4無水乙醇(absoluteethanol)。4.8苯酚/三氯甲烷/異戊醇(25:24:1,體積比）。4.10Tris-HCl：在800mL去離子水中溶解121.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，加入60mL濃鹽酸，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH值至7.5，加水定容至1L，分裝后121℃高壓滅菌20min。4.111.2mol/L氯化鈉溶液4.12CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA(pH8.0)。4.13TE緩沖液：配制每升TE緩沖液，應(yīng)在800mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL,O.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL，加水定容至1L，分裝后121℃高壓滅菌20min。1DB22/T2079—20144.14CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。4.15蛋白酶k溶液（20mg/mL）4.16引物及探針序列：天然皮革中牛、羊、豬PCR檢測引物信息見表1。表1牛、羊、豬PCR檢測引物信息檢測基因引物序列基因性質(zhì)適用范圍皮革及其加工品哺乳動物特上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’12SrRNA基因異基因下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’探針：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’上游引物：5’-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3’牛內(nèi)源基因牛生長素基因牛皮及其加下游引物：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’探針：5’-（FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3’上游引物：5'-ACACAACTTCTACCACAACCC-3'工品羊內(nèi)源基因豬內(nèi)源基因羊線粒體羊皮及其加下游引物：5'-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3'ATPase亞基工品探針：：5'-(FAM)–ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3’上游引物：5'-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’下游引物：5'-TGCCAAGCGGGTTGCT-3'豬線粒體豬皮及其加D-LOOP基因工品探針：5'-（FAM）-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA-(TAMRA)-3’5.1實時熒光PCR檢測系統(tǒng)。5.2高速冷凍離心機(jī)(12000r/min)。5.3渦旋混合器。5.5微量移液器：0.1μL~2.5μL，1μL~10μL，2μL~20μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL。用消毒的解剖刀去除皮張表面的毛發(fā)及其它附著物，用消毒的剪刀將皮張剪成1mm大小的顆粒。32DB22/T2079—20147.1.1稱取約100mg該顆粒置于2mL離心管中,以去離子水振蕩洗滌三次，10000r/min離心5min，傾去上層清液。7.1.2加入1.0mLCTAB裂解液及50μL蛋白酶K溶液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5次，65℃水浴過夜（12h-16h）。7.1.3室溫12000r/min離心10min，取上層溶液800μL，加入等體積的Tris飽和酚/三氯甲烷/異戊醇（25:24:1，v/v/v），輕輕顛倒離心管混勻，室溫12000r/min離心10min；取上層清液(水相)于一新離心管中，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24:1，v/v），顛倒混勻，室溫12000r/min離心10min，取上清液600μL，加入2倍體積的CTAB沉淀液，混勻，室溫靜置60min。12000r/min離心15min，棄上清液。加入500μL氯化鈉溶液溶解沉淀，然后加入500μL三氯甲烷，振蕩混勻，12000r/min離心10min，將上清液移至一新離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4℃靜置30min，4℃，12000r/min離心10min，小心棄去上清液，向沉淀加入500μL70%冷乙醇，洗滌沉淀，4℃，12000r/min離心5min，小心倒出上清液，室溫干燥后，將DNA溶于50μL去離子水中，-20℃保存。也可使用等效的商品化試劑盒提取模板DNA。7.2DNA濃度和純度的測定取5μLDNA溶液加二次蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按式（1）計算：c=A′N′50......................................(1)1000式中：c——DNA濃度，單位為微克每微升（μg/μL）；A——260nm處的吸光值；當(dāng)A260/A280比值在1.7～2.0之間時，適宜于PCR擴(kuò)增。7.3實時熒光PCR檢測7.3.1擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行樣品檢測時，應(yīng)設(shè)立空白對照、陰性對照和陽性對照實驗。實時熒光PCR反應(yīng)體系見表2試劑成分2×Real-timePCR預(yù)混液體積10μL1μL1μL1μL2μL5μL雙蒸水3DB22/T2079—2014實時熒光PCR反應(yīng)條件隨儀器不同略有改變，一般為：95℃/10min，1個循環(huán)；95℃/20s，59℃/30s，72℃/30s，45個循環(huán)，在每次循環(huán)的72℃/30s時收集熒光。檢測結(jié)果后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果。注：也可用等效的牛、羊、豬、貓、狗源性成分實時熒光PCR檢測試劑盒進(jìn)行實時熒光PCR檢測。8結(jié)果判定8.1PCR有效性判定空白對照：無FAM熒光信號，相應(yīng)Ct值>40。陰性對照：無FAM熒光信號，相應(yīng)Ct值>40。陽性對照：有FAM熒光信號，且FAM通道出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，Ct值≤36。否則判定為PCR無效。8.2檢測結(jié)果判定待測樣品牛/羊/豬源性基因檢測Ct值大于或等于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20～35之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出牛、羊、豬源性成分。待測樣品牛/羊/豬源性基因檢測Ct值小于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20～35之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出牛、羊、豬源性成分。