DB22-T2051-2014-飼料中肉毒梭菌測定PCR方法-吉林省

ICS07.100.30B20DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2051—2014飼料中肉毒梭菌測定PCR方法DeterminationofClostridiumbotulinuminfeedstuffsPCRmethod吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2051—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院、國家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國順德出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、邵秋榮、劉斌、周亮、劉曉暉、王瀟、任明月。IDB22/T2051—2014飼料中肉毒梭菌測定PCR方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中肉毒梭菌的PCR檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速篩選檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測下列術(shù)語和定義適用于本文件。肉毒梭菌為梭菌科梭菌屬革蘭氏陽性芽孢桿菌，厭氧，在適宜的培養(yǎng)基及特定的環(huán)境條件下產(chǎn)生一類具有很強毒性的神經(jīng)麻痹毒素，即肉毒毒素。樣品增菌后，培養(yǎng)物經(jīng)DNA提取制備PCR模板，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否有特征條帶，從而對飼料中是否污染肉毒梭菌進行快速檢驗。除特別說明以外，所有試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規(guī)定的一級水。所有試劑均用無DNA1DB22/T2051—2014表1引物序列擴增長度目標(biāo)菌類型引物序列bp上游引物：5’-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’下游引物：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’上游引物：5’-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’下游引物：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’上游引物：5’-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’下游引物：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’上游引物：5’-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3’下游引物：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’A型B型E型F型98349241011375.2皰肉培養(yǎng)基：見附錄A.1章。5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯（TPGY）：見附錄A.2章。5.4厭氧卵黃瓊脂：見附錄A.3章。5.5細菌基因組DNA提取純化試劑盒。5.6TaqDNA聚合酶。5.7dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，脫氧鳥苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脫氧胸苷三磷酸）。5.8溶菌酶。5.14乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2·2H2O）。5.1510×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀（KCl），15mmol/L氯化鎂（MgCl2）。5.19EDTA溶液，0.5mol/L，pH8.0：稱取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL去離子水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0，用水定容到1L，分裝后高壓滅菌。5.20Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去離子水中溶解121.1gTris，冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.21TE緩沖液（pH8.0）：在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和2mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0），用水定容到1L，分裝后高壓滅菌。5.22溶菌酶溶液：用TE配制，使用濃度為10mg/mL。5.23蛋白酶K溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解蛋白酶K為10mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。2DB22/T2051—20145.2550×TAE電泳緩沖液（儲備液）：稱取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0），溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用前稀釋成1×TAE電泳緩沖液（工作液）。5.26加樣緩沖液：稱取溴酚藍250mg，加水10mL，在室溫下過夜溶解；再稱取二甲腈藍250mg，用10mL水溶解；稱取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三種溶液，用水定容至100mL，在4℃保存。5.27陽性對照：含有擴增片段的質(zhì)?；駻、B、E、F型肉毒梭菌的基因組DNA。6儀器和設(shè)備6.1厭氧培養(yǎng)裝置。6.2生物安全柜：AII型。6.3恒溫培養(yǎng)箱：35℃±1℃和28℃±1℃。6.4高壓滅菌器。6.5高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.6PCR儀。6.7電泳儀。6.8凝膠成像分析系統(tǒng)。6.9核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.10恒溫水浴鍋。樣品經(jīng)均質(zhì)處理后及時接種培養(yǎng)。接種前，先將增菌培養(yǎng)基煮沸10min~15min，以排除溶解于培養(yǎng)基中的氧，并迅速冷卻，切勿搖動。每15mL增菌肉湯中接種1g~2g樣品，接種時將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管皰肉培養(yǎng)基，置35℃±1℃，同時接種兩管TPGY培養(yǎng)基，置28℃±1℃，厭氧培養(yǎng)5d。檢查培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉粒的消化和產(chǎn)生的氣味。若有生長，按7.2分離純培養(yǎng)物。若未見生長，可再培養(yǎng)10d。取1mL～2mL培養(yǎng)液置于螺旋帽試管中，加入等量過濾除菌的無水乙醇?；靹?，在室溫下放置1h?；?0℃加熱10min～15min以破壞其繁殖體。用接種環(huán)取1環(huán)～2環(huán)經(jīng)乙醇或加熱處理的培養(yǎng)物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種，置厭氧條件下35℃±1℃培養(yǎng)48h。挑取約10個單個的典型菌落。肉毒梭菌的菌落為隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生長并有不規(guī)則邊緣。在卵黃培養(yǎng)基上用斜射光檢查時，菌落表面通常呈虹彩樣，亦稱為珠色層。彩帶通常向外延伸，繼而菌落產(chǎn)生不規(guī)則外形。3DB22/T2051—2014培養(yǎng)液一部分用于DNA提取，剩余培養(yǎng)液置于4℃保存，以備確證試驗使用。7.3DNA提取取1.4mLTPGY培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000r/min離心2min，棄去上清液。菌體沉淀用1.0mLTE緩沖液洗兩次后重懸于120μL的25%蔗糖溶液中。加入10mg/mL溶菌酶溶液120μL，混勻，37℃±1℃水浴30min；然后加入20%SDS溶液30μL，輕輕混勻，室溫放置5min；再加入10mg/mL蛋白酶K溶液9.0μL，混勻后37℃±1℃水浴30min。懸浮液采用細菌基因組DNA提取純化試劑盒并按試劑盒說明書進行操作。提取的DNA溶液可于-20℃保存。7.4DNA濃度測定取10μLDNA溶液加蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值。DNA的濃度按照式（1）計算，當(dāng)A260/A280比值在1.5～2.1之間時，適宜于PCR擴增。擴增前將所有樣品DNA調(diào)至10ng/μL～50ng/μL。c=A′N′501000.............................................................................................(1)式中：c——DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。10×PCR緩沖液2.5μL、dNTP(10mmol/L)0.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL、DNA模板（10ng/μL～50ng/μL）2μL、用無菌去離子水補足體積至25μL。針對A、B、E、F型肉毒梭菌，進行多個PCR擴增，每個PCR反應(yīng)管檢測一種類型的肉毒梭菌。95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，40個循環(huán)，72℃后延伸10min。結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。檢驗過程中分別設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照?？瞻讓φ赵O(shè)為以無菌水代替DNA模板；陰性對照采用非肉毒梭菌的DNA作為PCR反應(yīng)的模板；陽性對照采用含有擴增片段的質(zhì)?；駻、B、E、F型肉毒梭菌的基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。取1.2g～1.5g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分熔化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5μg/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5μL～8μLPCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣，用分子量標(biāo)記作參照。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。4DB22/T2051—20148.1陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，判定為PCR結(jié)果陽性，按附錄B進行確證試驗。8.2陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，判定為PCR結(jié)果陰性，可直接報告。8.3實驗中設(shè)置的陰性對照、空白對照和陽性對照PCR檢測結(jié)果應(yīng)符合上述情況。否則，任一種對照如果出現(xiàn)非上述正常結(jié)果，應(yīng)重做試驗。9結(jié)果表述9.1PCR結(jié)果陰性，直接報告“未檢出A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.2確證試驗結(jié)果為檢出肉毒梭菌，則報告“檢出A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.3確證試驗結(jié)果為未檢出肉毒梭菌，則報告“未檢出A、B、E、F型肉毒梭菌”。10生物安全措施為了保護實驗室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測，所有培養(yǎng)物應(yīng)小心處置，并按GB/T27403中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。11廢棄物處理和防止污染的措施5DB22/T2051—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1皰肉培養(yǎng)基A.1.1成分：a)b)c)d)e)f)g)新鮮牛肉蛋白胨500.0g30.0g5.0g酵母浸膏磷酸二氫鈉葡萄糖5.0g3.0g可溶性淀粉蒸餾水2.0g1000mLA.1.2制法將新鮮除脂肪和筋膜的牛肉500g切碎，加入蒸餾水。加熱至沸點，再以文火煮1h。充分冷卻，經(jīng)紗布過濾，擠出余液。加入其他成分，用蒸餾水將液體體積補足至1000mL。調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1，經(jīng)粗濾紙過濾。在15mm×150mm試管中加入碎肉渣至3cm高，然后加入肉湯，超過肉渣表面約4cm，上面覆蓋一層液體石蠟，厚度為0.3cm～0.4cm。在121℃高壓滅菌20min。A.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯（TPGY）A.2.1成分：硫乙醇酸納蒸餾水將固體成分溶于1000mL蒸餾水中，再分裝15mm×150mm試管，每管15mL。上面覆蓋一層液體石蠟，厚度為0.3cm～0.4cm。在121℃高壓滅菌10min。最終pH為7.0±0.1。放冰箱內(nèi)保存，若2周內(nèi)不用則棄掉。臨用前，將基礎(chǔ)液用蒸汽或煮沸加熱10min～15min，以排除游離氧，迅速冷卻。6DB22/T2051—2014a)b)c)d)e)f)酵母浸膏胰胨50.0g5.0g蛋白胨氯化鈉瓊脂20.0g5.0g20.0g1000mL蒸餾水在121℃下高壓滅菌15min。最終pH為7.0±0.2。A.3.2卵黃乳狀液用硬刷洗涮2個~3個雞蛋，瀝干。將雞蛋放在0.1%氯化汞溶液中浸泡1h，再用70%乙醇浸泡30min。取出雞蛋，以無菌操作打開，棄去蛋白。用注射器取出蛋黃，放入滅菌容器，加等量滅菌生理鹽水，充分混合，存于4℃?zhèn)溆谩.3.3制法每500mL瓊脂基礎(chǔ)液（48℃~50℃）加80mL卵黃乳狀液，充分混合，制成平板。室溫放置2d，或35℃放置24h。剔除污染的平板，將無菌平板存于冰箱。7DB22/T2051—2014BB附錄B（規(guī)范性附錄）確證試驗B.1試劑B.1.1明膠磷酸鹽緩沖液：明膠2g，磷酸氫二鈉4g，蒸餾水100