《核酸檢測(cè)技術(shù)》課件

核酸檢測(cè)技術(shù)探索分子診斷的前沿技術(shù)了解現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)掌握疾病預(yù)防與醫(yī)療健康的核心技術(shù)什么是核酸檢測(cè)核酸基礎(chǔ)DNA為雙鏈結(jié)構(gòu)RNA為單鏈結(jié)構(gòu)生物信息載體攜帶遺傳信息控制生命活動(dòng)檢測(cè)意義分子水平診斷精準(zhǔn)醫(yī)療基礎(chǔ)核酸檢測(cè)的發(fā)展歷程11970年代限制性內(nèi)切酶應(yīng)用分子克隆技術(shù)建立21983年P(guān)CR技術(shù)首次提出科學(xué)家KaryMullis發(fā)明31990-2000年代實(shí)時(shí)熒光PCR發(fā)展檢測(cè)靈敏度大幅提高421世紀(jì)高通量測(cè)序興起CRISPR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展核酸檢測(cè)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的地位診斷金標(biāo)準(zhǔn)精確度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)方法病原體檢測(cè)快速識(shí)別傳染源遺傳病篩查早期干預(yù)提高預(yù)后腫瘤精準(zhǔn)診療指導(dǎo)靶向治療方案核酸分子的結(jié)構(gòu)特征DNA結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基配對(duì)規(guī)則遺傳信息穩(wěn)定存儲(chǔ)RNA結(jié)構(gòu)單鏈結(jié)構(gòu)更易降解多種功能性分子結(jié)構(gòu)意義堿基互補(bǔ)配對(duì)為檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物關(guān)鍵核酸提取與純化樣本裂解破碎細(xì)胞膜和核膜去除蛋白質(zhì)酚-氯仿提取法核酸沉淀乙醇沉淀回收質(zhì)量檢測(cè)純度與濃度測(cè)定分子診斷基礎(chǔ)檢測(cè)結(jié)果解讀臨床意義分析信號(hào)獲取熒光/電化學(xué)檢測(cè)3核酸擴(kuò)增特異性放大目標(biāo)序列樣本前處理核酸提取與純化核酸檢測(cè)適用范圍傳染病病毒、細(xì)菌、真菌檢測(cè)腫瘤突變檢測(cè)與分型遺傳病單基因病與多基因疾病3產(chǎn)前檢測(cè)無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)藥物基因組學(xué)個(gè)體化用藥指導(dǎo)核酸檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)與局限優(yōu)勢(shì)靈敏度極高特異性強(qiáng)可定量分析自動(dòng)化程度高局限成本較高需專業(yè)技術(shù)人員設(shè)備要求高受樣本質(zhì)量影響大核酸檢測(cè)的基本工作流程樣本采集采集合適樣本嚴(yán)格防污染措施核酸提取裂解細(xì)胞純化核酸核酸擴(kuò)增PCR或其他方法特異性引物設(shè)計(jì)結(jié)果檢測(cè)信號(hào)獲取數(shù)據(jù)分析與解讀PCR技術(shù)原理變性95°C雙鏈分離退火55-65°C引物結(jié)合延伸72°C合成新鏈循環(huán)30-40次指數(shù)增殖實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)優(yōu)勢(shì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程CT值原理定量分析基礎(chǔ)熒光檢測(cè)方式探針法或染料法應(yīng)用場(chǎng)景病毒載量測(cè)定數(shù)字PCR技術(shù)樣本分區(qū)分成數(shù)千微滴絕對(duì)定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線高靈敏度檢測(cè)稀有突變高精確度降低系統(tǒng)誤差等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)概述LAMP技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增60-65°C條件下反應(yīng)RPA技術(shù)重組酶聚合酶擴(kuò)增37-42°C低溫反應(yīng)共同優(yōu)勢(shì)無需熱循環(huán)儀快速獲得結(jié)果核酸雜交技術(shù)1探針結(jié)合特異識(shí)別目標(biāo)序列雜交條件溫度影響特異性信號(hào)產(chǎn)生熒光或其他標(biāo)記顯示高通量測(cè)序（NGS）簡介文庫構(gòu)建DNA片段化接頭連接大規(guī)模并行測(cè)序同時(shí)測(cè)數(shù)百萬片段堿基逐個(gè)識(shí)別數(shù)據(jù)分析生物信息學(xué)處理序列比對(duì)與變異檢出基因芯片檢測(cè)探針固定芯片表面陣列化1樣本標(biāo)記熒光或生物素標(biāo)記雜交特異性結(jié)合目標(biāo)信號(hào)檢測(cè)芯片掃描儀讀取CRISPR/Cas核酸檢測(cè)靶標(biāo)識(shí)別gRNA特異結(jié)合Cas蛋白激活切割活性釋放信號(hào)放大側(cè)向切割報(bào)告分子結(jié)果檢測(cè)熒光或試紙條顯示檢測(cè)樣本類型血液循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)全血/血漿/血清拭子呼吸道病原體檢測(cè)咽拭子/鼻拭子尿液泌尿系統(tǒng)感染檢測(cè)無創(chuàng)樣本采集結(jié)果解讀與質(zhì)量控制質(zhì)控要素陰性對(duì)照陽性對(duì)照內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線形態(tài)結(jié)果判定CT值評(píng)估閾值設(shè)定重復(fù)性分析臨床關(guān)聯(lián)性RT-PCR檢測(cè)技術(shù)詳解逆轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)化為cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶催化PCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA放大特異引物識(shí)別信號(hào)檢測(cè)熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CT值分析結(jié)果RT-PCR優(yōu)勢(shì)與不足優(yōu)勢(shì)RNA病毒高效檢測(cè)敏感性低至幾拷貝檢出不足RNA易降解風(fēng)險(xiǎn)時(shí)間成本操作復(fù)雜耗時(shí)長熒光定量PCR（qPCR）應(yīng)用端點(diǎn)PCR法簡介PCR反應(yīng)常規(guī)熱循環(huán)擴(kuò)增電泳制備凝膠制備與上樣電泳分離DNA片段大小分離成像分析熒光染料顯示條帶數(shù)字PCR實(shí)際應(yīng)用案例LAMP等溫?cái)U(kuò)增應(yīng)用65°C反應(yīng)溫度恒溫水浴即可30分鐘檢測(cè)時(shí)間快速出結(jié)果6條引物數(shù)量高特異性設(shè)計(jì)109倍擴(kuò)增倍數(shù)超高效擴(kuò)增LAMP法優(yōu)勢(shì)恒溫反應(yīng)無需昂貴熱循環(huán)儀速度快20-60分鐘完成可視化結(jié)果肉眼可觀察沉淀現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)適合基層和野外RPA等溫?cái)U(kuò)增特色低溫條件37-42℃反應(yīng)體溫即可啟動(dòng)能耗極低高速反應(yīng)10-20分鐘檢測(cè)重組酶介導(dǎo)無需熱變性步驟應(yīng)用場(chǎng)景現(xiàn)場(chǎng)快速診斷資源有限地區(qū)便攜式設(shè)備集成核酸雜交技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景HPV分型探針區(qū)分不同亞型DNA指紋法醫(yī)鑒定應(yīng)用FISH技術(shù)染色體異常檢測(cè)探針設(shè)計(jì)與優(yōu)化靶點(diǎn)選擇高度保守區(qū)域熔解溫度Tm值合理設(shè)計(jì)長度優(yōu)化15-30個(gè)核苷酸特異性驗(yàn)證生物信息學(xué)分析高通量測(cè)序在基因組學(xué)個(gè)體化醫(yī)療靶向藥物篩選2全基因組測(cè)序整體變異圖譜外顯子組測(cè)序編碼區(qū)變異篩查靶向測(cè)序已知基因深度分析基因芯片檢測(cè)流程樣本標(biāo)記熒光或生物素PCR擴(kuò)增目標(biāo)芯片雜交溫度控制嚴(yán)格特異性結(jié)合靶標(biāo)清洗步驟洗去非特異信號(hào)降低背景干擾掃描分析激光掃描儀讀取軟件分析信號(hào)強(qiáng)度微陣列芯片的局限已知序列限制僅能檢測(cè)已知變異無法發(fā)現(xiàn)新突變分辨率受限點(diǎn)密度有物理極限檢測(cè)精度需提高背景干擾交叉雜交風(fēng)險(xiǎn)假陽性可能性CRISPR/Cas報(bào)告系統(tǒng)靶標(biāo)結(jié)合gRNA識(shí)別特定序列1特異性切割Cas蛋白激活側(cè)向切割活性切割報(bào)告分子信號(hào)產(chǎn)生熒光或其他指示CRISPR/Cas在新冠檢測(cè)SHERLOCK系統(tǒng)Cas13a蛋白應(yīng)用RNA檢測(cè)能力強(qiáng)靈敏度可達(dá)10拷貝DETECTR系統(tǒng)Cas12a蛋白為核心側(cè)向流試紙條顯示現(xiàn)場(chǎng)快速診斷10-30分鐘獲得結(jié)果高特異性識(shí)別病毒變異主流檢測(cè)方法對(duì)比方法靈敏度特異性速度成本RT-PCR高高4-6小時(shí)中-高LAMP中-高中30-60分鐘低數(shù)字PCR極高極高4-6小時(shí)高CRISPR高高30-60分鐘中核酸檢測(cè)在新冠疫情防控1000萬+日檢測(cè)量全球高峰期單日量4小時(shí)檢測(cè)時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR流程40Ct陽性判斷值國際通用標(biāo)準(zhǔn)10拷貝檢出限高靈敏度檢測(cè)能力流感病毒核酸檢測(cè)多重PCR同時(shí)檢測(cè)多種亞型區(qū)分能力甄別H1N1/H3N2等快速診斷指導(dǎo)抗病毒治療乙肝、丙肝病毒核酸檢測(cè)腫瘤分子診斷ctDNA液體活檢無創(chuàng)腫瘤監(jiān)測(cè)靶向藥物伴隨診斷個(gè)體化治療方案復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)微小殘留病灶檢測(cè)遺傳病基因檢測(cè)單基因病直接檢測(cè)特定突變產(chǎn)前篩查無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)家族風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估遺傳咨詢依據(jù)新生兒篩查早期干預(yù)提高預(yù)后藥物基因組學(xué)與伴隨診斷個(gè)體化治療最優(yōu)劑量與藥物選擇療效預(yù)測(cè)藥物反應(yīng)性基因檢測(cè)不良反應(yīng)預(yù)防代謝酶基因多態(tài)性分析4藥物靶點(diǎn)檢測(cè)特定靶向藥物基因狀態(tài)食品與環(huán)境核酸檢測(cè)食品安全轉(zhuǎn)基因成分鑒定食源性病原體檢測(cè)肉類來源鑒別環(huán)境監(jiān)測(cè)水體微生物檢測(cè)土壤污染評(píng)估生物多樣性研究技術(shù)特點(diǎn)高通量篩查多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)定量分析能力異地/應(yīng)急核酸檢測(cè)移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室車載核酸檢測(cè)系統(tǒng)便攜式設(shè)備野外快速檢測(cè)遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)傳輸結(jié)果云端分析現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用災(zāi)區(qū)、邊遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)國內(nèi)外核酸檢測(cè)行業(yè)現(xiàn)狀技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)解讀國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T37892-2019核酸檢測(cè)通用要求實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室CAP認(rèn)證要求生物安全規(guī)范BSL-2實(shí)驗(yàn)室要求樣本處理安全標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化與信息化趨勢(shì)家用自測(cè)與便攜式檢測(cè)樣本自采集鼻拭子自檢操作簡化采樣流程即時(shí)檢測(cè)便攜式檢測(cè)設(shè)備20-30