《核酸的酶促降解》課件

核酸的酶促降解從分子機(jī)理到應(yīng)用領(lǐng)域，探索核酸降解的關(guān)鍵酶學(xué)過程課程介紹核酸降解基礎(chǔ)基本概念與降解原理酶學(xué)機(jī)制詳解內(nèi)切酶、外切酶作用機(jī)理實驗與應(yīng)用醫(yī)學(xué)診斷、基因工程應(yīng)用案例什么是核酸DNA結(jié)構(gòu)脫氧核糖雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基配對：A-T、G-CRNA結(jié)構(gòu)單鏈核糖核酸堿基配對：A-U、G-C核酸的重要性遺傳信息儲存生命密碼2蛋白質(zhì)合成指導(dǎo)生命活動細(xì)胞分裂維持生命延續(xù)核酸降解的意義物質(zhì)循環(huán)回收核苷酸資源防御功能清除外源核酸基因表達(dá)調(diào)控RNA穩(wěn)定性細(xì)胞發(fā)育程序性清除遺傳物質(zhì)經(jīng)歷哪些降解途徑酶促降解通過特異性核酸酶催化化學(xué)降解通過化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)破壞物理降解通過輻射、熱能等物理因素酶促降解與非酶促降解對比特點(diǎn)酶促降解非酶促降解特異性高低效率高低條件溫和苛刻可控性可精確調(diào)控難以控制什么是核酸酶定義能催化核酸分子中磷酸二酯鍵水解的酶類分類依據(jù)底物特異性切割方式作用位點(diǎn)重要性參與DNA修復(fù)降解外源核酸調(diào)控基因表達(dá)核酸酶的主要功能分解功能將核酸大分子降解為小分子修復(fù)功能去除DNA損傷部分防御功能清除外源核酸調(diào)控功能控制基因表達(dá)水平外切核酸酶作用特點(diǎn)從核酸鏈末端開始降解降解方向5'→3'或3'→5'方向代表酶ExonucleaseI、III內(nèi)切核酸酶切割位置DNA/RNA分子內(nèi)部序列特異性常識別特定堿基序列應(yīng)用領(lǐng)域基因工程常用工具核酸酶專一性底物特異性DNA酶：專一降解DNARNA酶：專一降解RNA1鏈特異性單鏈特異：僅作用于單鏈雙鏈特異：僅作用于雙鏈位點(diǎn)特異性序列特異：識別特定序列結(jié)構(gòu)特異：識別特定構(gòu)象DNA酶詳解DNaseI非特異性內(nèi)切酶需要二價陽離子產(chǎn)生5'-磷酸和3'-羥基DNaseII內(nèi)切酶酸性環(huán)境最適產(chǎn)生3'-磷酸和5'-羥基RNase詳解RNaseA降解單鏈RNA的內(nèi)切酶RNaseH降解RNA-DNA雜合體中RNA鏈RNaseIII雙鏈RNA特異性內(nèi)切酶RNaseP參與tRNA前體加工逆轉(zhuǎn)錄酶與核酸降解降解活性具有RNaseH活性降解對象RNA-DNA雜合體中的RNA生物學(xué)意義病毒復(fù)制過程中去除RNA模板靶標(biāo)特異性酶促降解siRNA通過RISC復(fù)合物降解特定mRNAmiRNA抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解CRISPR靶向切割特定DNA序列輔助酶及其作用金屬離子Mg2?、Ca2?、Zn2?等穩(wěn)定酶構(gòu)象參與催化反應(yīng)輔因子ATP提供能量增強(qiáng)酶活性輔助蛋白結(jié)合核酸增強(qiáng)特異性促進(jìn)酶復(fù)合物形成酶促降解需要哪些條件溫度最適溫度通常為37°CpH值DNaseI：中性環(huán)境DNaseII：酸性環(huán)境離子濃度二價金屬離子Mg2?、Ca2?水分子提供水解反應(yīng)所需水分子影響酶活性的主要因素抑制劑EDTA：螯合金屬離子SDS：變性蛋白質(zhì)激活劑二價金屬離子還原劑：維持活性基團(tuán)溫度波動過高：酶失活過低：反應(yīng)速率降低4蛋白修飾磷酸化：調(diào)節(jié)活性糖基化：影響穩(wěn)定性DNA酶降解DNA流程結(jié)合識別酶與DNA底物結(jié)合催化切割水解磷酸二酯鍵產(chǎn)物釋放釋放核苷酸或寡核苷酸酶循環(huán)利用進(jìn)入下一輪催化循環(huán)DNaseI作用機(jī)制作用位點(diǎn)DNA小溝結(jié)構(gòu)酶結(jié)構(gòu)含兩個鈣離子結(jié)合位點(diǎn)催化中心His-Glu-His三聯(lián)體DNaseII作用環(huán)境DNaseII在溶酶體酸性環(huán)境（pH4.5-5.5）中高效工作，無需金屬離子，主要降解凋亡細(xì)胞和吞噬的外源DNARNase降解RNA流程單鏈RNA底物RNaseA：切割嘧啶堿基后產(chǎn)生3'-磷酸和5'-羥基雙鏈RNA底物RNaseIII：切割雙鏈區(qū)域留下2-3個核苷酸突出RNA-DNA雜合體RNaseH：特異降解RNA鏈DNA鏈保持完整RNaseA作用機(jī)制切割位點(diǎn)嘧啶（C、U）3'端兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)關(guān)鍵氨基酸His12：質(zhì)子受體His119：質(zhì)子供體Lys41：穩(wěn)定過渡態(tài)反應(yīng)速率kcat=1400s-1Km=9μMRNaseH作用于RNA-DNA雜合體1底物識別特異識別RNA-DNA雜合區(qū)域2RNA鏈降解選擇性切割RNA鏈磷酸二酯鍵3DNA鏈保留DNA鏈完整無損實驗應(yīng)用去除反轉(zhuǎn)錄后的RNA模板內(nèi)切與外切酶協(xié)同作用內(nèi)切酶初始切割將長鏈核酸切成片段生成中間片段寡核苷酸片段2外切酶進(jìn)一步降解從末端逐步水解產(chǎn)生單核苷酸核苷酸單體回收利用4核酸降解的分子機(jī)制水解反應(yīng)水分子進(jìn)攻磷原子SN2反應(yīng)形成五配位磷過渡態(tài)催化中心酸堿催化協(xié)同作用中間產(chǎn)物與最終產(chǎn)物初始底物完整DNA/RNA鏈2中間產(chǎn)物多核苷酸片段3最終產(chǎn)物單核苷酸降解產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)處理重新利用進(jìn)入核苷酸代謝途徑補(bǔ)救合成合成新的核苷酸能量代謝釋放化學(xué)能排泄清除尿酸、尿素等形式排出調(diào)控降解的信號傳導(dǎo)接收信號細(xì)胞凋亡、DNA損傷等信號信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子激活核酸酶表達(dá)上調(diào)核酸酶表達(dá)4酶活性調(diào)節(jié)磷酸化等翻譯后修飾細(xì)胞器與降解定位溶酶體細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)線粒體其他細(xì)胞器溶酶體是主要的核酸降解場所，DNaseII在此高效工作；細(xì)胞核中降解與修復(fù)密切相關(guān)；線粒體有自己的核酸降解系統(tǒng)不同細(xì)胞類型中的降解差異白細(xì)胞高表達(dá)核酸酶吞噬外源核酸中性粒細(xì)胞釋放DNA形成NET肝細(xì)胞高代謝活性降解效率高清除循環(huán)核酸神經(jīng)細(xì)胞低代謝率核酸穩(wěn)定性高嚴(yán)格控制降解過程病理狀態(tài)下的酶促降解異常自身免疫疾病SLE：核酸酶活性降低核酸-抗體復(fù)合物積累促進(jìn)自身免疫反應(yīng)腫瘤異常核酸酶表達(dá)與基因組不穩(wěn)定相關(guān)可作為診斷標(biāo)志物神經(jīng)退行性疾病DNA修復(fù)和降解異常神經(jīng)元累積損傷加速細(xì)胞死亡酶促降解的檢測方法1電泳分析觀察DNA/RNA片段遷移距離熒光法熒光標(biāo)記底物降解信號變化3吸光度法260nm光吸收增加放射性同位素標(biāo)記高靈敏度跟蹤降解過程科學(xué)實驗常用的核酸酶酶名實驗用途注意事項DNaseIRNA純化去除DNA需Mg2?、Ca2?RNaseADNA純化去除RNA耐熱性強(qiáng)，難滅活限制性內(nèi)切酶DNA克隆特定緩沖液和溫度S1核酸酶單鏈核酸降解需鋅離子醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用樣本純化去除干擾核酸游離核酸檢測腫瘤早期篩查酶學(xué)診斷自身免疫標(biāo)志物基因工程中的應(yīng)用1基因編輯CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向切割2基因克隆限制性內(nèi)切酶精確切割3核酸純化特異性去除雜質(zhì)4DNA操作末端修飾、連接等新藥開發(fā)與遞送系統(tǒng)siRNA療法沉默特定致病基因酶遞送系統(tǒng)針對病毒基因組控釋技術(shù)防止過早酶解生物制劑純化過程中的應(yīng)用宿主DNA殘留生物制劑中的主要雜質(zhì)核酸酶處理降解殘留DNA片段過濾分離去除降解產(chǎn)物質(zhì)量控制核酸殘留量<10pg/劑量食品與環(huán)境檢測24小時檢測時長核酸酶處理樣本后的快速檢測99.9%檢測準(zhǔn)確率食品中微生物核酸特異性識別0.1pg檢測靈敏度高精度檢測環(huán)境中的微量污染物法醫(yī)鑒定中的核酸降解死亡時間推測DNA降解程度時間相關(guān)建立降解速率模型樣本處理抑制內(nèi)源性核酸酶低溫保存添加EDTA等螯合劑農(nóng)業(yè)生物技術(shù)轉(zhuǎn)基因作物基因編輯技術(shù)優(yōu)化作物性狀病蟲害防治RNA干擾技術(shù)靶向抑制害蟲基因分子育種核酸酶輔助基因組編輯植物病害診斷核酸酶處理提高檢測精確度病毒與細(xì)菌的核酸降解策略微生物進(jìn)化出多種防御機(jī)制抵抗外源核酸入侵：限制性修飾系統(tǒng)特異性切割外源DNA，CRISPR-Cas系統(tǒng)記憶并切割入侵序列，病毒則開發(fā)出多種策略逃避宿主降解免疫系統(tǒng)中的核酸降解1模式識別TLR9識別CpGDNATLR3識別雙鏈RNA2炎癥反應(yīng)激活NFκB通路釋放促炎細(xì)胞因子3核酸清除核酸酶降解外源核酸防止過度炎癥4自身免疫核酸酶缺陷導(dǎo)致自身核酸積累引發(fā)SLE等疾病突變和疾病關(guān)聯(lián)研究核酸酶基因突變與多種疾病相關(guān)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者核酸酶活性降低導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生；艾康奇綜合征表現(xiàn)為嚴(yán)重皮膚光敏感性新型核酸酶的開發(fā)定向進(jìn)化隨機(jī)突變篩選改良性能增強(qiáng)特異性與催化效率結(jié)構(gòu)設(shè)計基于晶體結(jié)構(gòu)理性設(shè)計改變活性位點(diǎn)氨基酸嵌合酶融合不同功能域創(chuàng)造新功能復(fù)合酶環(huán)境適應(yīng)性開發(fā)極端環(huán)境下活性酶高溫、低pH穩(wěn)定性增強(qiáng)人工設(shè)計的核酸酶CRISPR-CasRNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶系統(tǒng)鋅指核酸酶融合FokI切割域TALENTAL蛋白與核酸酶融合納米技術(shù)與核酸降解納米載體保護(hù)核酸酶免受環(huán)境降解提高體內(nèi)半衰期靶向遞送將核酸酶遞送至特定組織細(xì)胞減少非特異性作用多功能化同時攜帶多種功能分子實現(xiàn)診斷與治療