治療用犬間充質(zhì)干細(xì)胞的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

ICS

B

T/CVDA

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVDAXX-XXXX

治療用犬間充質(zhì)干細(xì)胞（糖尿病）

Caninemesenchymalstemcellsfortherapeuticuse(Diabetes)

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國獸藥協(xié)會發(fā)布

治療用犬間充質(zhì)干細(xì)胞（糖尿?。?/p>

1.范圍

本文件規(guī)定了治療用犬間充質(zhì)干細(xì)胞的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、使用說明、標(biāo)簽、

包裝、儲存、運(yùn)輸、廢棄物處理要求、犬糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和犬糖尿病間充質(zhì)干細(xì)胞治療方案。

本文件適用于治療用犬間充質(zhì)干細(xì)胞的生產(chǎn)、檢測、質(zhì)控和犬糖尿病的間充質(zhì)干細(xì)胞治療。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過本文件的規(guī)范性引用而成為本文件必不可少的條款。

凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最

新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

T/CSCB0001干細(xì)胞通用要求

中華人民共和國獸藥典（2020年版）

GB/T27532-2011犬瘟熱診斷技術(shù)

GB/T27533-2011犬細(xì)小病毒病診斷技術(shù)

WS281-2008狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)

2018AAHA犬貓?zhí)悄虿」芾碇改?/p>

3.術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1犬間充質(zhì)干細(xì)胞Caninemesenchymalstemcell

一類貼壁培養(yǎng)后呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(紡錘形或梭形)、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、

成軟骨等分化能力的干細(xì)胞。

注：犬間充質(zhì)干細(xì)胞可由多種組織(如骨髓、臍帶、胎盤、羊膜、脂肪、臍帶血

等)分離得到，也可以通過分化或轉(zhuǎn)分化等方式獲得；不同來源的犬間充質(zhì)干細(xì)胞在

基因表達(dá)譜和分化能力方面存一定差異，但具有類似的基本生物學(xué)特性。

3.2糖尿病diabetes

由多種病因引起的代謝紊亂，犬空腹血糖濃度持續(xù)達(dá)到8.4mmol/L或食后血糖濃度持續(xù)達(dá)

到11.2mmol/L，即可診斷為糖尿病。其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴有胰島素分泌不足和（或）作用

障礙，導(dǎo)致碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，造成多種器官的慢性損傷、功能障礙甚至衰

竭。

3.3血糖bloodglucose

血液中的葡萄糖，用mmol/L表示，犬血糖參考值為3.3mmol/L～6.7mmol/L。犬應(yīng)激時，有

時血糖可達(dá)9.7mmol/L，但持續(xù)幾小時或幾天，便恢復(fù)正常。

3.4尿糖urineglucose

尿液中的葡萄糖，當(dāng)血糖濃度增高到一定程度時，腎小管不能將尿液中的葡萄糖全部重吸

收，尿糖增高呈陽性，臨床用“+”號表示。一般情況下，尿糖可以反映出血糖的情況，但尿糖

還受其他許多因素的影響，有時與血糖并不完全一致。

4.縮略語

CD--分化簇(ClusterofDifferentiation)

CDV--犬瘟熱（Caninedistemper）

CPV--犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus)

IDO--吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3Dioxygenase)

INF-γ--干擾素γ(Interferongamma)

MSC--間充質(zhì)干細(xì)胞（Caninemesenchymalstemcell）

RV--狂犬病毒（Rabiesvirus）

STR--短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeat)

TNF-α--腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α)

5.犬間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)要求

5.1原材料和輔料

5.1.1應(yīng)符合T/CSCB0001要求。

5.1.2應(yīng)建立供體細(xì)胞采集的供體犬評估與篩選標(biāo)準(zhǔn)、采集方法、運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)和交接標(biāo)準(zhǔn)，保

證動物福利和細(xì)胞的安全。

5.1.3供體應(yīng)篩查CDV,CPV和RV，確保為陰性，并記錄結(jié)果。

5.2關(guān)鍵質(zhì)量屬性

5.2.1細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時呈紡錘形或梭形的成纖維細(xì)胞態(tài)，形態(tài)均一。

5.2.2染色體核型

正常核型應(yīng)為78,XX或78，XY。

5.2.3細(xì)胞存活率

未凍存細(xì)胞存活率≥95%，且凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率≥90%。

5.2.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白

在體外培養(yǎng)條件下，CD29、CD44、CD90陽性率≥95%；CD34、CD45陽性率≤2%。

5.2.5免疫調(diào)節(jié)

經(jīng)炎癥因子IFN-γ誘導(dǎo)后顯著增強(qiáng)犬MSC表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)。與活化的T淋巴

細(xì)胞共培養(yǎng)，能抑制T淋巴細(xì)胞增殖及分泌INF-γ和TNF-α。

5.2.6三系分化

具有成骨、成脂、成軟骨的分化潛能。

5.2.7成瘤性

免疫缺陷動物(如裸鼠)體內(nèi)成瘤試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

5.2.8微生物

真菌、細(xì)菌、支原體、內(nèi)毒素、犬瘟熱（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、狂犬?。≧V）應(yīng)

為陰性。

5.3細(xì)胞制備過程控制

5.3.1MSC的擴(kuò)增、凍存、復(fù)蘇等過程控制應(yīng)符合T/CSCB0001要求。

5.3.2MSC的細(xì)胞STR檢測結(jié)果應(yīng)與供體細(xì)胞保持一致。

6.犬間充質(zhì)干細(xì)胞檢驗(yàn)方法

6.1供體犬篩選

按照附錄A的方法進(jìn)行篩選

6.2細(xì)胞形態(tài)

二維培養(yǎng)條件下，用明視場細(xì)胞顯微鏡進(jìn)行觀察。

6.3染色體核型

按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》檢驗(yàn)。

6.4細(xì)胞存活率

按照附錄B的方法檢驗(yàn)。

6.5細(xì)胞表面標(biāo)志物

按照附錄C的方法檢驗(yàn)。

6.6免疫調(diào)節(jié)

6.6.1誘導(dǎo)IDO表達(dá)

按照附錄D的方法檢驗(yàn)。

6.6.2抑制T細(xì)胞增殖

按照附錄E的方法檢驗(yàn)。

6.6.3抑制T細(xì)胞分泌INF-γ,TNF-α

按照附錄F的方法檢驗(yàn)。

6.7三系分化

6.7.1成骨分化

按照附錄G的方法檢驗(yàn)。

6.7.2成脂分化

按照附錄H的方法檢驗(yàn)。

6.7.3成軟骨分化

按照附錄I的方法檢驗(yàn)。

6.8成瘤性

按照附錄J的方法檢驗(yàn)。

6.9微生物

6.9.1真菌

按照《中國獸藥典（2020年版）》三部中“3306無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)法”項檢測。

6.9.2細(xì)菌

按照《中國獸藥典（2020年版）》三部中“3306無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)法”項檢測。

6.9.3支原體

按照《中國獸藥典（2020年版）》三部中“3308支原體檢驗(yàn)法”項檢測。

6.9.4內(nèi)毒素

按照《中國獸藥典（2020年版）》一部中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法”檢測。

6.9.5CDV

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27532-2011《犬瘟熱診斷技術(shù)》檢測。

6.9.6CPV

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27533-2011《犬細(xì)小病毒病診斷技術(shù)》檢測。

6.9.7RV

按照國家標(biāo)準(zhǔn)WS281-2008《狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)》檢測。

7.檢驗(yàn)規(guī)則

7.1抽樣方法和數(shù)量

7.1.1在同一個生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線，同一來源,同一代次，同一方法制備出來的產(chǎn)品

為一批。

7.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3個最小包裝單元。

7.2出廠檢驗(yàn)

7.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn),并附檢驗(yàn)報告。

7.2.2出廠檢驗(yàn)項目應(yīng)包括5.2規(guī)定的所有項目。

7.3復(fù)核檢查

根據(jù)需要，應(yīng)由專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)。

7.4判定規(guī)則

7.4.1出廠檢驗(yàn)項目全部符合5.2規(guī)定，判為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則

判為不合格品。

7.4.2復(fù)核檢驗(yàn)項目全部符合5.2規(guī)定，判為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則

判為不合格品。

8.使用說明

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

a)產(chǎn)品名稱；

b)細(xì)胞類型、組織來源及細(xì)胞代次；

c)細(xì)胞數(shù)量和存活率；

d)生產(chǎn)日期；

e)生產(chǎn)批號；

f)生產(chǎn)組織；

g)儲存條件及使用期限；

h)運(yùn)輸條件；

i)使用方法；

j)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號；

k)生產(chǎn)地址；

l)聯(lián)系方式；

m)郵政編碼；

n)注意事項。

9.標(biāo)簽

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

a)產(chǎn)品名稱；

b)細(xì)胞類型、組織來源及細(xì)胞代次；

c)細(xì)胞數(shù)量和存活率；

d)儲存條件及使用期限；

e)生產(chǎn)日期；

f)生產(chǎn)批號；

g)生產(chǎn)組織。

10.包裝,儲存和運(yùn)輸

10.1包裝

應(yīng)選擇對犬間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的材料和容器。

10.2儲存

10.2.1應(yīng)符合T/CSCB0001要求。

10.2.2應(yīng)在低于-130℃環(huán)境下儲存。

10.3運(yùn)輸

10.3.1應(yīng)符合T/CSCB0001要求。

10.3.2凍存細(xì)胞應(yīng)在干冰或低于-130℃條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞建議在4℃～25℃運(yùn)輸。

11.犬間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬糖尿病

11.1犬糖尿病的診斷

應(yīng)符合2018AAHA犬貓?zhí)悄虿」芾碇改系脑\斷方法。

11.2犬糖尿病的治療方法

按照附錄K的方法輸注干細(xì)胞進(jìn)行治療。

附件:

附錄A：供體犬評估與篩選，犬組織樣品采集和運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)

附錄B：細(xì)胞存活率檢測，細(xì)胞計數(shù)法

附錄C：細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測，流式細(xì)胞法

附錄D：誘導(dǎo)IDO表達(dá)檢測，PCR法

附錄E：抑制T細(xì)胞增殖檢測，CFSE標(biāo)記法

附錄F：抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α檢測胞內(nèi)因子染色法

附錄G：成骨分化檢測，茜素紅S染色法

附錄H：成脂分化檢測，油紅O染色法

附錄I：成軟骨分化檢測，阿爾新藍(lán)染色法

附錄J：成瘤性檢測，免疫缺陷小鼠檢測法

附錄K：犬間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬糖尿病的方法

附錄A

(規(guī)范性)

供體犬評估與篩選,犬組織樣品采集和運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)

A.1供體犬篩選標(biāo)準(zhǔn)

A.1.1供體犬年齡應(yīng)不大于5歲（60個月），以確保供體犬沒有出現(xiàn)明顯衰老跡象。

A.1.2健康狀況篩查:供體犬應(yīng)由專業(yè)獸醫(yī)進(jìn)行全面的健康評估，包括體格檢查,血液檢查，

并且具有有效的疫苗接種記錄（至少包含犬瘟熱，犬細(xì)小和狂犬病疫苗），確保沒有潛在的遺

傳或者傳染疾病。

A.1.3品種和遺傳背景：供體犬的品種信息和遺傳背景應(yīng)當(dāng)有完整記錄，以排除潛在的遺傳

風(fēng)險或疾病。

A.1.4心理和行為特征篩查：供體犬應(yīng)具有良好的心理和行為特征。挑選脾氣穩(wěn)定，友好和

適應(yīng)新環(huán)境的犬作為供體，以減少在組織采集和實(shí)驗(yàn)過程中的應(yīng)激和不適感。

A.2犬組織采集方法

A.2.1用于干細(xì)胞分離的犬組織的采集應(yīng)獲得當(dāng)?shù)貏游锔＠蛡惱砦瘑T會的批準(zhǔn)。

A.2.2麻醉與鎮(zhèn)定：使用合適的麻醉方法,確保供體犬在組織采集過程中沒有疼痛或者不適

感。

A.2.3組織采集技術(shù)：根據(jù)目的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的不同，選擇合適的組織采集技術(shù)，例如

皮下脂肪，骨髓和產(chǎn)后廢棄組織應(yīng)選用不一樣的手術(shù)采集方法。手術(shù)全程遵循無菌原則。

A.2.3供體犬術(shù)后護(hù)理：術(shù)后應(yīng)對供體犬應(yīng)進(jìn)行體溫，行為和身體狀況等進(jìn)行監(jiān)測；傷口需

定期清潔和更換包扎，避免犬舔舐或咬傷；遵循適當(dāng)?shù)奶弁垂芾碛媱?，包括使用合適的陣痛藥

物；為供體犬提供干凈舒適的環(huán)境，清潔的飲水和易消化的食物，以確保其快速恢復(fù)和動物福

利。

A.3犬組織運(yùn)輸和交接標(biāo)準(zhǔn)

A.3.1犬組織運(yùn)輸條件：應(yīng)將組織置于大小合適的無菌容器中，并使用適當(dāng)?shù)木彌_溶液保存。

運(yùn)輸過程保證組織溫度保持在4℃～8℃，并于8h內(nèi)將組織樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞

分離。

A.3.2交接標(biāo)準(zhǔn)：制定詳細(xì)的交接文件，記錄犬的身份信息、健康狀況、組織類型、采集日

期、過程和采集人信息等。

附錄B

（規(guī)范性）

細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞計數(shù)法

B.1儀器和設(shè)備

B.1.1明視場顯微鏡。

B.1.2血球計數(shù)板。

B.2試劑

除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MQ去離子水。

B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

B.2.2臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(B.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。

B.3檢測步驟

B.3.1細(xì)胞懸液制備

收集待檢測細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（B.2.1）配制細(xì)胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個血球

計數(shù)板（B.1.2）的1mm2的方格中的細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)為20個～50個細(xì)胞。如果高于200個細(xì)胞，

則需要進(jìn)行稀釋。

B.3.2細(xì)胞染色

按1:1的體積比將臺盼藍(lán)染液（B.2.2）與細(xì)胞懸液（B.3.1）混合均勻。

B.3.3細(xì)胞計數(shù)

將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板（B.1.2）計數(shù)槽上，取10μL混合液（B.3.2）滴在一側(cè)計數(shù)室的

蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)

板之間，靜置30s，將計數(shù)板置明視場顯微鏡（B.1.1）下對被染色的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計

數(shù)。

對16×25規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個1mm2的中格（即

100個小格）計數(shù)。對25×16規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5

個中格（即80個小格）計數(shù)。當(dāng)遇到位于大格線上的細(xì)胞，一般只計數(shù)大方格的上方和左線上

的細(xì)胞（或只計數(shù)下方和右方線上的細(xì)胞）。

按照步驟B.3.2～B.3.3再重復(fù)測定一個樣品。

B.3.4細(xì)胞存活率計算

B.4計算與分析

細(xì)胞存活率按式（B.1）進(jìn)行計算：

X=(M-S)/M×100%……(B.1)

式中：

X—細(xì)胞存活率；

M—細(xì)胞總數(shù)；

S—染色的細(xì)胞數(shù)。

計算兩次計數(shù)細(xì)胞存活率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。

B.5精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

附錄C

(規(guī)范性)

細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測流式細(xì)胞法

C.1儀器和設(shè)備

C.1.1流式細(xì)胞儀。

C.1.2水平離心機(jī)。

C.1.3電子天平。

C.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。

C.2.2牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

C.2.3疊氮鈉（NaN?）。

C.2.4抗犬CD29、CD44、CD90、CD34、CD45抗體及同型對照抗體。

注:若選用人源或鼠源抗體,應(yīng)將人源或鼠源抗原序列進(jìn)行比對,確定其與犬源抗

原序列相似度在95%以上方可用于鑒定犬間充質(zhì)干細(xì)胞。

C.2.5按照相應(yīng)要求使用電子天平（C.1.3）配制流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋

液。

C.3樣品保存

洗滌液和標(biāo)記后的樣品于2℃～8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。

C.4檢測步驟

C.4.1樣品準(zhǔn)備

收集細(xì)胞，使用水平離心機(jī)（C.1.2）300g離心4min，棄上清。然后用洗滌液清洗一遍，使

用水平離心機(jī)（C.1.2）300g離心4min，棄上清。

C.4.2抗體孵育

按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用。抗體孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機(jī)

（C.1.2）300g離心4min，棄上清。

C.4.3過濾上機(jī)

用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（C.1.1）應(yīng)用手冊

上機(jī)檢測。

C.4.4圈門設(shè)定原則

首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)

Isotype對照組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性

細(xì)胞。抗體Isotype作為陰性對照。

C.5結(jié)果分析

得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。

附錄D

(規(guī)范性)

誘導(dǎo)IDO表達(dá)檢測PCR法

D.1儀器和設(shè)備

D.1.1核酸含量測定儀。

D.1.2PCR擴(kuò)增儀。

D.1.3電泳儀。

D.1.4凝膠成像儀。

D.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

D.2.1重組IFN-γ。

D.2.2RNA提取試劑盒。

D.2.3RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒。

D.2.4PCR引物。

D.2.5TaqDNA聚合酶。

D.2.6Ladder內(nèi)標(biāo)。

D.3檢測步驟

D.3.1IFN-Y處理

根據(jù)附錄B方法測定，計算犬間充質(zhì)干細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。按(1×10?～4×10?)細(xì)胞/cm2接

種，在犬間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加IFN-γ（10ng/mL～30ng/mL），正常培養(yǎng)12h～36h。同

時設(shè)立未使用IFN-γ處理的犬間充質(zhì)干細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)同樣時間。

D.3.2犬間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA提取

根據(jù)RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行，并使用核酸含量測定儀(D.1.1)進(jìn)行核酸含量測定。

D.3.3逆轉(zhuǎn)錄PCR

根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行，使用PCR擴(kuò)增儀（D.1.2）獲得cDNA，并

擴(kuò)增IDO基因。

D.3.4PCR產(chǎn)物電泳

根據(jù)電泳應(yīng)用手冊進(jìn)行電泳檢測。

D.3.5凝膠成像

根據(jù)凝膠成像儀應(yīng)用手冊，使用電泳儀（D.1.3），進(jìn)行電泳檢測。

D.4結(jié)果分析

使用凝膠成像儀（D.1.4）進(jìn)行成像，未使用IFN-γ處理的犬間充質(zhì)干細(xì)胞在擴(kuò)增產(chǎn)物片段

大小范圍內(nèi)無明顯條帶,IFN-γ刺激后在擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小范圍內(nèi)可見明顯條帶。

附錄E

(規(guī)范性)

抑制T細(xì)胞增殖檢測CFSE標(biāo)記法

E.1儀器和設(shè)備

E.1.1血球計數(shù)板。

E.1.2顯微鏡。

E.1.3水平離心機(jī)。

E.1.4流式細(xì)胞儀。

E.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

E.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

E.2.20.25%EDTA-胰酶。

E.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（E.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

E.2.4植物凝集素。

E.2.5淋巴細(xì)胞分離液。

E.2.6抗體（如：anti-CD3抗體）。

E.2.7羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）染料。

E.3檢測步驟

E.3.1T細(xì)胞分離及染色

E.3.1.1T細(xì)胞分離

利用淋巴細(xì)胞分離液（.2.5），分離犬外單核周血細(xì)胞（PBMC），用適量無菌磷酸鹽緩沖

液（E.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（E.1.3）洗滌2次。孵育抗體后用適量無菌磷酸鹽緩沖液

（E.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（E.1.3）洗滌2次。重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為5×10?細(xì)胞

/mL,40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機(jī)分選。

E.3.1.2T細(xì)胞染色

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及顯微鏡（E.1.2）計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃

度。然后進(jìn)行CFSE標(biāo)記，根據(jù)CFSE產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

E.3.2T細(xì)胞與犬間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)

E.3.2.1T細(xì)胞增殖

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1,1）及顯微鏡（E.1.2）計算犬T細(xì)胞懸液活細(xì)

胞濃度，按1×106細(xì)胞/mL接種培養(yǎng)，并用（2～5）μg/mL的植物凝集素（E.2.4）刺激T細(xì)胞

增殖，設(shè)立未用植物凝集素（E.2.4）刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)96h，用于檢測刺激后

T細(xì)胞增殖百分比A。

E.3.2.2犬間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖

利用0.25%EDTA-胰酶消化犬間充質(zhì)干細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)附錄B方法測定，

計算T細(xì)胞與犬間充質(zhì)干細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。犬間充質(zhì)干細(xì)胞按2×10?細(xì)胞/mL接種，細(xì)胞

貼壁后，將T細(xì)胞按5:1（T細(xì)胞：犬間充質(zhì)干細(xì)胞）的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，并用（2～5）pg/mL

的植物凝集素（E.2.4）刺激T細(xì)胞增殖，培養(yǎng)96h，用于檢測犬間充質(zhì)干細(xì)胞抑制后T細(xì)胞增

殖百分比C。

E.3.3T細(xì)胞收集并檢測

收集培養(yǎng)后的T細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（E.1.3）

洗滌2次，通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（E.1.4）應(yīng)用手冊上機(jī)檢測。

E.3.4圈門設(shè)定原則

首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，排除沒有

被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。然后根據(jù)未用植物凝集素刺激的T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，在分群1的

基礎(chǔ)上畫出CFSE母代細(xì)胞位置，根據(jù)CFSE母代細(xì)胞位置畫出子代細(xì)胞群2（即為T細(xì)胞增殖

的百分比）。

E.4結(jié)果分析

得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算犬間充質(zhì)干細(xì)胞對T

增殖的抑制率。抑制率按式（E.1）進(jìn)行計算：

Y=(A-C)/A×100%……………(E.1)

式中：

Y--抑制率；

A--單獨(dú)T細(xì)胞（刺激）CFSE子代細(xì)胞的百分比；

C--與犬間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞（刺激）CFSE子代細(xì)胞的百分比。

附錄F

(規(guī)范性)

抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α檢測胞內(nèi)因子染色法

F.1儀器和設(shè)備

F.1.1血球計數(shù)板。

F.1.2顯微鏡。

F.1.3水平離心機(jī)。

F.1.4流式細(xì)胞儀。

F.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

F.2.20.25%EDTA-胰酶。

F.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（F.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

F.2.4佛波酯（PMA）。

F.2.5淋巴細(xì)胞分離液。

F.2.6抗體（如anti-IFN-γ抗體、anti-TNF-α抗體）。

F.2.7布雷非德菌素A（BFA）。

F.2.8離子霉素。

F.2.9皂苷（Saponin）。

F.2.104%多聚甲醛。

F.3檢測步驟

F.3.1T細(xì)胞分離

利用淋巴細(xì)胞分離液（F.2.5），分離犬外周血PBMC，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（F.2.1）

并使用水平離心機(jī)離心（F.1.3）洗滌2次。待抗體孵育（F.2.6）后用適量無菌磷酸鹽緩沖液

（F.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（F.1.3）洗滌2次。重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為5×107細(xì)胞/mL，

40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機(jī)分選。

F.3.2T細(xì)胞與犬間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)

F.3.2.1T細(xì)胞炎癥因子分泌

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（F.1.1）及顯微鏡（F.1.2）計算T細(xì)胞懸液活細(xì)胞

濃度，按1×106細(xì)胞/mL接種培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h～6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛

波酯（F.2.4）、10μg/mL布雷非德菌素A（F.2.7）和1μg/mL離子霉素（F.2.8），用于檢測IFN-γ

陽性的T細(xì)胞比例A?，和TNF-a陽性的T細(xì)胞比例A?。

F.3.2.2犬間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T細(xì)胞炎癥因子分泌

利用0.25%EDTA-胰酶消化犬間充質(zhì)干細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)附錄B方法測定，

使用血球計數(shù)板（F.1.1）及顯微鏡（F.1.2）計算T細(xì)胞與犬間充質(zhì)干細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度，犬

間充質(zhì)干細(xì)胞按2×10?細(xì)胞/mL接種，細(xì)胞貼壁后，將T細(xì)胞按5:1（T細(xì)胞：犬間充質(zhì)干細(xì)胞）

的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h～6h，往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯（F.2.4）、

10μg/mL布雷非德菌素A（F.2.7）和1μg/mL離子霉素（F.2.8），用于檢測犬間充質(zhì)干細(xì)胞抑制

后IFN-γ陽性的T細(xì)胞比例C?，和TNF-α陽性的T細(xì)胞比例C?。

F.3.3T細(xì)胞收集并標(biāo)記

收集培養(yǎng)后的T細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（F.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（F.1.3）

洗滌2次。用4%多聚甲醛（F.2.10）固定細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（F.2.1）并使用水平

離心機(jī)離心（F.1.3）洗滌1次。使用0.1%～0.2%皂苷（F.2.9）處理穿膜，然后孵育IFN-γ和

TNF-α抗體，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）并使用水平離心機(jī)離心（F.1.3）洗滌1次。最

后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機(jī)檢測。

F.3.4圈門設(shè)定原則

首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)

Isotype組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出IFN-γ陽性的細(xì)胞群2和TNF-α陽性的細(xì)胞群3，排

除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。

F.4結(jié)果分析

得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算犬間充質(zhì)干細(xì)胞對T

細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α的抑制率。

抑制率按式（F.1）和式（F.2）進(jìn)行計算：

IFN-γ抑制率=(A?-C;)/A?×100%……(F.1)

式中：

A1--單獨(dú)T細(xì)胞的IFN-γ陽性率；

C?--與人間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞的IFN-γ陽性率。

TNF-α抑制率=（A?-C?）/A?×100%………………(F.2)

式中：

A?--單獨(dú)T細(xì)胞的TNF-α陽性率；

C?--與人間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞的TNF-α陽性率。

附錄G

(規(guī)范性)

成骨分化檢測茜素紅S染色法

G.1儀器和設(shè)備

G.1.1血球計數(shù)板。

G.1.2明視場顯微鏡。

G.1.3水平離心機(jī)。

G.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

G.2.1磷酸鹽緩法液：pH為7.4。

G.2.20.25%EDTA-胰酶。

G.2.3臺盼藍(lán)染色：使用時，用磷酸鹽緩沖液（G.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

G.2.4成骨誘導(dǎo)液。

G.2.5茜素紅S染色試劑盒。

G.3檢測步驟

G.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

G.3.1.1細(xì)胞消化

使用水平離心機(jī)（G.1.3）離心收集犬間充質(zhì)干細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕

重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘細(xì)胞團(tuán)塊。

G.3.1.2細(xì)胞計數(shù)

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（G.1.1）及明視場顯微鏡（G.1.2）計算犬間充質(zhì)干

細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

G.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d～21d。

G.3.3鈣結(jié)節(jié)染色

鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行。

G.4結(jié)果分析

顯微鏡下可見散在橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。

附錄H

(規(guī)范性)

成脂分化檢測油紅O染色法

H.1儀器和設(shè)備

H.1.1血球計數(shù)板。

H.1.2明視場顯微鏡。

H.1.3水平離心機(jī)。

H.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

H.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

H.2.20.25%EDTA-胰酶。

H.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（H.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

H.2.4成脂誘導(dǎo)液。

H.2.5油紅O染色試劑盒。

H.3檢測步驟

H.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

H.3.1.1細(xì)胞消化

使用水平離心機(jī)（H.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，

避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。

H.3.1.2細(xì)胞計數(shù)

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（H.1.1）及明視場顯微鏡（H.1.2）計算犬間充質(zhì)干

細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

H.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成脂誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d～21d。

H.3.3脂滴染色

脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。

H.4結(jié)果分析

顯微鏡下可見細(xì)胞中含大小不等橙紅色的脂滴。

附錄I

(規(guī)范性)

成軟骨分化檢測阿爾新藍(lán)染色法

I.1儀器和設(shè)備

I.1.1血球計數(shù)板。

I.1.2明視場顯微鏡。

I.1.3水平離心機(jī)。

I.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。

I.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

I.2.20.25%EDTA-胰酶。

I.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（I.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

I.2.4成軟骨誘導(dǎo)液。

I.2.5阿爾新藍(lán)染色試劑盒。

I.3檢測步驟

I.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

I.3.1.1細(xì)胞消化

使用水平離心機(jī)（I.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避

免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。

I.3.1.2細(xì)胞計數(shù)

根據(jù)附錄B方法測定，使用血球計數(shù)板（I.1.1）及明視場顯微鏡（I.1.2）計算細(xì)胞懸液活

細(xì)胞濃度。

I.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成軟骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d