《病原生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法》課件

病原生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法探索微觀世界的關(guān)鍵技術(shù)與方法掌握病原體研究的實(shí)驗(yàn)技能確保實(shí)驗(yàn)安全與結(jié)果準(zhǔn)確課程概述課程目標(biāo)掌握病原生物實(shí)驗(yàn)基本技能主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)安全、培養(yǎng)技術(shù)、鑒定方法學(xué)習(xí)要求理論與實(shí)踐相結(jié)合第一章：實(shí)驗(yàn)室安全與生物安全個人防護(hù)防護(hù)服、面罩等裝備操作規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程與安全操作風(fēng)險管控危險評估與應(yīng)急處理實(shí)驗(yàn)室安全基本原則個人防護(hù)實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡環(huán)境安全通風(fēng)、消毒、隔離操作安全規(guī)范流程、避免交叉感染緊急處理應(yīng)急預(yù)案、事故報告生物安全等級BSL-1低風(fēng)險微生物，開放工作臺BSL-2中等風(fēng)險病原體，生物安全柜BSL-3高風(fēng)險病原體，氣密性實(shí)驗(yàn)室4BSL-4最高風(fēng)險病原體，全身正壓防護(hù)個人防護(hù)裝備（PPE）防護(hù)服一次性或可重復(fù)使用，防止污染手套乳膠、丁腈、防穿刺口罩和呼吸器防飛沫、氣溶膠防護(hù)生物安全柜原理HEPA過濾、氣流屏障保護(hù)類型Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類安全柜使用前開啟15分鐘，紫外消毒使用后表面消毒，整理工作區(qū)實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理固體廢棄物專用黃色垃圾袋高壓蒸汽滅菌封口標(biāo)記液體廢棄物漂白劑處理存放30分鐘專用下水道排放銳器廢棄物硬質(zhì)防刺容器不超過3/4容量專業(yè)機(jī)構(gòu)回收實(shí)驗(yàn)室消毒與滅菌物理方法高壓蒸汽滅菌（121℃，15-30分鐘）干熱滅菌（160-180℃，2小時）紫外線照射（30-60分鐘）化學(xué)方法75%酒精（表面消毒）含氯消毒劑（廣譜殺菌）甲醛熏蒸（空間消毒）適用場景工作臺面：75%酒精培養(yǎng)基：高壓蒸汽玻璃器皿：干熱滅菌第二章：微生物培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基制備營養(yǎng)物質(zhì)配比培養(yǎng)條件溫度、濕度、氣體接種技術(shù)無菌操作、均勻分布觀察方法菌落特征鑒別培養(yǎng)基制備常用培養(yǎng)基類型普通培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基制備步驟配料、溶解、調(diào)pH、分裝、滅菌質(zhì)量控制無菌測試、pH值檢測、生長支持力測試無菌操作技術(shù)70%酒精濃度表面消毒最佳濃度15cm火焰高度酒精燈最佳工作高度10-15°試管角度最佳操作傾斜角度30分鐘預(yù)熱時間生物安全柜使用前預(yù)熱細(xì)菌培養(yǎng)方法平板劃線分離單菌落傾注平板測細(xì)菌數(shù)量液體培養(yǎng)獲得大量菌體真菌培養(yǎng)方法特殊培養(yǎng)基沙氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)條件25-28℃，濕度50-60%培養(yǎng)時間3-7天觀察菌落生長病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是病毒研究最常用方法雞胚培養(yǎng)適用于流感病毒動物模型用于復(fù)雜病毒研究厭氧培養(yǎng)技術(shù)厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)厭氧罐、厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋厭氧指示劑亞甲藍(lán)、甲酚紅指示氧氣存在操作要點(diǎn)快速操作，減少氧氣接觸時間第三章：顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡常規(guī)觀察，100-1000倍熒光顯微鏡特殊標(biāo)記，觀察活性電子顯微鏡超高倍率，觀察超微結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)和原理目鏡、物鏡、聚光鏡、反光鏡組成光路系統(tǒng)調(diào)節(jié)和使用方法低倍物鏡對焦，逐步轉(zhuǎn)高倍，調(diào)節(jié)光圈日常維護(hù)鏡頭紙清潔鏡片，防塵罩保護(hù)，干燥環(huán)境保存油鏡使用技術(shù)油鏡特點(diǎn)100倍，分辨率0.2μm使用步驟低倍對焦，加油，轉(zhuǎn)油鏡清潔保養(yǎng)鏡頭紙擦凈油脂熒光顯微鏡原理和應(yīng)用激發(fā)特定波長，發(fā)射熒光觀察標(biāo)記的特定結(jié)構(gòu)活菌/死菌區(qū)分樣品制備熒光染料標(biāo)記熒光抗體結(jié)合熒光蛋白表達(dá)觀察技巧暗室環(huán)境控制曝光時間防止熒光淬滅電子顯微鏡掃描電鏡（SEM）觀察表面結(jié)構(gòu)分辨率達(dá)10nm樣品需金屬噴涂透射電鏡（TEM）觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)分辨率達(dá)0.1nm樣品需超薄切片樣品制備固定：戊二醛、鋨酸脫水：乙醇梯度包埋：環(huán)氧樹脂顯微鏡下的細(xì)菌形態(tài)觀察革蘭氏染色：鑒別G+/G-細(xì)菌抗酸染色：結(jié)核分枝桿菌檢測莢膜染色：觀察保護(hù)性結(jié)構(gòu)第四章：微生物分離與純化技術(shù)純種獲得單一菌種培養(yǎng)分離技術(shù)從混合物中獲得目標(biāo)微生物采樣處理樣品收集與前處理分離培養(yǎng)技術(shù)稀釋平板法逐級稀釋，降低菌濃度劃線分離法四區(qū)劃線法分離單菌落挑取單菌落接種環(huán)取獨(dú)立菌落純化技術(shù)反復(fù)劃線法連續(xù)3-5次劃線分離單菌落分離法挑取獨(dú)立菌落轉(zhuǎn)接純度檢查形態(tài)觀察，生化特性分子驗(yàn)證PCR或測序確認(rèn)特殊微生物的分離培養(yǎng)溫度(℃)生長周期(天)厭氧菌：無氧環(huán)境，特殊培養(yǎng)基放線菌：生長緩慢，抗生素添加霉菌：酸性培養(yǎng)基，抑制細(xì)菌第五章：微生物鑒定技術(shù)1形態(tài)學(xué)鑒定最基礎(chǔ)的鑒定方法生化鑒定代謝特性分析血清學(xué)鑒定抗原抗體特異反應(yīng)4分子生物學(xué)鑒定基因水平精確鑒定形態(tài)學(xué)鑒定菌落特征大小、形狀、顏色、質(zhì)地、邊緣顯微形態(tài)球菌、桿菌、螺旋菌染色特性革蘭氏、抗酸性、莢膜生理生化鑒定IMViC試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)VP試驗(yàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)葡萄糖乳糖蔗糖甘露醇酶活性測定過氧化氫酶氧化酶尿素酶明膠酶血清學(xué)鑒定凝集試驗(yàn)可見的抗原抗體聚集載玻片法試管法沉淀試驗(yàn)可溶性抗原與抗體反應(yīng)環(huán)狀沉淀免疫擴(kuò)散ELISA技術(shù)酶標(biāo)記檢測微量物質(zhì)直接法間接法分子生物學(xué)鑒定PCR技術(shù)特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)序列DNA測序16SrRNA基因序列分析基因芯片高通量基因表達(dá)分析分子指紋圖譜RFLP、RAPD、PFGE自動化鑒定系統(tǒng)API系統(tǒng)微量生化反應(yīng)條帶VITEK系統(tǒng)全自動生化反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)指紋圖譜快速鑒定第六章：抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法最常用的篩查方法瓊脂稀釋法金標(biāo)準(zhǔn)MIC測定肉湯稀釋法液體培養(yǎng)測定MICE-test方法梯度擴(kuò)散技術(shù)紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理抗生素從紙片擴(kuò)散形成抑菌圈操作步驟制備平板，鋪菌，放置紙片，孵育結(jié)果判讀測量抑菌圈直徑，對比標(biāo)準(zhǔn)表瓊脂稀釋法1MIC測定最低抑菌濃度，金標(biāo)準(zhǔn)方法操作方法藥物梯度稀釋，加入瓊脂，傾注平板優(yōu)缺點(diǎn)精確但耗時，多樣本同時測試肉湯稀釋法操作步驟液體培養(yǎng)基系列稀釋加菌標(biāo)準(zhǔn)菌液接種孵育16-24小時培養(yǎng)判讀觀察渾濁度確定MICE-test方法1-2天實(shí)驗(yàn)周期快速獲得精確MIC值0.016最低濃度μg/ml，高靈敏度256最高濃度μg/ml，寬測試范圍15種同時測試單平板可測多種抗生素自動化藥敏系統(tǒng)VITEK系統(tǒng)：快速結(jié)果，2-18小時Phoenix系統(tǒng)：高準(zhǔn)確性，多樣本處理MicroScan：全自動接種，標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果第七章：血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1應(yīng)用診斷病原體特異性檢測2檢測方法凝集、沉淀、ELISA技術(shù)抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合是核心原理抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)特異性抗體只與特定抗原結(jié)合互補(bǔ)結(jié)構(gòu)決定結(jié)合位點(diǎn)親和力結(jié)合強(qiáng)度，決定反應(yīng)靈敏度結(jié)合常數(shù)Kd表示反應(yīng)類型凝集、沉淀、中和補(bǔ)體結(jié)合、免疫熒光凝集反應(yīng)直接凝集顆粒性抗原與抗體直接反應(yīng)間接凝集可溶性抗原先與載體結(jié)合操作要點(diǎn)適宜pH和離子強(qiáng)度3結(jié)果判讀肉眼或顯微鏡觀察凝集現(xiàn)象4沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)試管中形成沉淀環(huán)適用于抗原濃度測定雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)瓊脂凝膠中形成沉淀線Ouchterlony法免疫電泳電場中分離蛋白質(zhì)形成特異性沉淀弧線補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在支原體診斷中準(zhǔn)確率最高操作復(fù)雜但特異性好需標(biāo)準(zhǔn)化試劑和嚴(yán)格質(zhì)控ELISA技術(shù)直接法酶標(biāo)記抗體直接檢測抗原間接法一抗結(jié)合，二抗檢測夾心法兩種抗體夾住抗原競爭法樣品抗原與標(biāo)記抗原競爭免疫熒光技術(shù)直接法熒光素標(biāo)記抗體直接與抗原結(jié)合間接法未標(biāo)記一抗與熒光標(biāo)記二抗組合應(yīng)用范圍病原體定位，自身抗體檢測第八章：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1核酸提取獲取純凈DNA/RNAPCR擴(kuò)增特異性放大目標(biāo)基因測序分析確定核酸序列信息核酸提取技術(shù)DNA提取裂解：SDS、蛋白酶K純化：酚氯仿法沉淀：乙醇或異丙醇RNA提取裂解：含RNase抑制劑純化：異硫氰酸胍方法保存：-80℃，加RNase抑制劑質(zhì)量控制濃度：OD260/280測定純度：比值1.8-2.0完整性：瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)94°C變性溫度DNA雙鏈分離55-65°C退火溫度引物結(jié)合目標(biāo)區(qū)域72°C延伸溫度DNA聚合酶合成新鏈30-40次循環(huán)次數(shù)指數(shù)級擴(kuò)增目標(biāo)片段Real-timePCR原理和優(yōu)勢實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增，定量分析探針類型SYBRGreen、TaqMan、分子信標(biāo)數(shù)據(jù)分析Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線儀器要求實(shí)時監(jiān)測熒光，精確溫度控制基因測序技術(shù)Sanger測序：單一片段，高準(zhǔn)確性高通量測序：海量數(shù)據(jù)，平行處理第三代測序：長讀長，實(shí)時分析基因克隆技術(shù)目標(biāo)基因獲取PCR擴(kuò)增或酶切載體選擇質(zhì)粒、噬菌體、BAC連接反應(yīng)T4DNA連接酶轉(zhuǎn)化與篩選抗生素或藍(lán)白斑篩選第九章：病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)病毒培養(yǎng)細(xì)胞系、雞胚、動物模型病毒滴定測定病毒濃度病毒檢測形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)中和試驗(yàn)抗體特異性檢測病毒分離與培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)原代細(xì)胞傳代細(xì)胞系懸浮細(xì)胞病毒接種方法吸附法直接添加法貼壁細(xì)胞消化法CPE觀察細(xì)胞融合細(xì)胞變圓空泡形成細(xì)胞裂解病毒滴定技術(shù)空斑計數(shù)法單個病毒形成可見空斑計算PFU/ml適用于裂解性病毒TCID50法半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量稀釋度系列觀察CPEReed-Muench法計算血凝滴定病毒凝集紅細(xì)胞計算HAU值流感、麻疹等病毒病毒中和試驗(yàn)原理特異性抗體中和病毒感染能力操作步驟血清稀釋，加入病毒，孵育，接種細(xì)胞結(jié)果判讀觀察CPE抑制，計算中和抗體滴度病毒核酸檢測1RT-PCRRNA病毒檢測金標(biāo)準(zhǔn)基因型鑒定測序分析病毒變異病毒載量定量PCR測定拷貝數(shù)快速檢測等溫擴(kuò)增技術(shù)第十章：免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1功能分析免疫細(xì)胞活性測定2分子檢測細(xì)胞因子、抗體