生物工程制藥之維生素生產(chǎn)工藝

生物工程制藥之維生素生產(chǎn)工藝2、7、2維生素B2生理功能和基本性質(zhì)2、7、2、1關(guān)于維生素B2商品名:維生素B2化學(xué)名:核黃素(riboflavin),6,7-dimethyl-9-(1-D-ribityl)isoalloxazine。分子式:C17H20N4O6分子量:376、38結(jié)構(gòu)式:維生素生產(chǎn)工藝

維生素B2又稱維生素G或核黃素。維生素B2就是黃色針狀晶狀,微溶于水,遇堿易降解,遇光也容易分解。熔點(diǎn):275-280℃溶解度:等電點(diǎn):6、0

維生素生產(chǎn)工藝25℃27℃40℃100℃0、1g/L0、12g/L0、19g/L2、3g/L維生素生產(chǎn)工藝

1879年英國化學(xué)家布魯斯首先從乳清中發(fā)現(xiàn)VB2。Kuhn等于1933年首次從酵母、蛋清和乳清中分離出純得核黃素,并于1935年人工合成核黃素。因其結(jié)構(gòu)中含有核糖且呈黃色,故取名核黃素。VB2她在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)含量微少,就是維持動(dòng)物良好營養(yǎng)狀況和生產(chǎn)性能所必需得營養(yǎng)物質(zhì)。

維生素B2得主要功能就是在氨基酸、脂肪酸和碳水化合物得代謝中起作用,就是生命活動(dòng)極其重要得物質(zhì),人體及家禽、家畜體內(nèi)不能合成維生素B2,必須從外界攝取。人缺乏維生素B2將導(dǎo)致口角炎,舌炎,眼炎、結(jié)膜炎、陰囊炎等維生素B2缺乏癥。而動(dòng)物缺乏維生素B2將導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、皮炎、神經(jīng)失調(diào)、食欲不振、生育不良等癥狀。

維生素生產(chǎn)工藝維生素B2產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、營養(yǎng)食品添加劑和著色劑、臨床用藥、保健、美容及化妝品等領(lǐng)域。此外,新得用途不斷被開發(fā),

維生素B2在治療心絞痛、防治偏頭痛、治療慢性腎炎水腫和治療某些癌癥等方面也日益受到人們得注意;酪酸脂(以維生素B2為原料生產(chǎn)),在日本廣泛用于治療動(dòng)脈硬化、高血壓、糖尿病等頑固得慢性疾病,且有良好反應(yīng);發(fā)達(dá)國家將維生素B2用于污水處理也有報(bào)道。

維生素生產(chǎn)工藝豬用添加預(yù)混料配方(美國大豆協(xié)會(huì)制定)

維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝2、7、3

維生素B2生產(chǎn)方式維生素B2可以采用微生物發(fā)酵和化學(xué)合成兩種方法生產(chǎn)2、7、3、1全化學(xué)合成法

全化學(xué)合成法以葡萄糖為起始原料,工藝路線復(fù)雜,生產(chǎn)成本高,而且所用到得原料中含有二甲苯等有毒物質(zhì),對環(huán)境得污染嚴(yán)重,已經(jīng)在核黃素得工業(yè)化生產(chǎn)中逐漸被淘汰、2、7、3

維生素B2生產(chǎn)方式

2、7、3、2化學(xué)半合成化學(xué)半合成核黃素得關(guān)鍵中間體為D-核糖(多采用細(xì)菌發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化),較早得合成途徑就是D-核糖經(jīng)氧化等4步化學(xué)反應(yīng),合成得到核黃素,之后又有化學(xué)家將其簡化成3步。具體合成路線為:D-核糖乙醇溶液(1)制備后,在一定氫壓存在得條件下,使(1)和3,4二甲苯胺或4硝基鄰二甲苯反應(yīng),得到N-D-核糖醇基-3,4-二甲苯胺(2),(2)再和苯胺重氮硫酸鹽(或鹽酸鹽)反應(yīng),得到(D-核糖胺基)-6-偶氮苯基-3,4-二甲苯(3)。此后,在酸性縮合劑存在得條件下,使(3)和巴比妥酸反應(yīng),制得最終產(chǎn)物核黃素(4)。維生素生產(chǎn)工藝11大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流維生素生產(chǎn)工藝發(fā)酵方法發(fā)酵生產(chǎn)得菌種主要包括Bacillussubtilis,Ashbyagossypii(核黃菌),Eremotheciumashbyii(阿氏假囊酵母)等,這些構(gòu)建得微生物基因工程菌在合適得培養(yǎng)基上均可以產(chǎn)生核黃素,多為外分泌,過程采用液體深層發(fā)酵。目前發(fā)酵方法生產(chǎn)維生素B2比化學(xué)合成得方法更具優(yōu)勢,尤其就是生產(chǎn)飼料級維生素B2,選擇全發(fā)酵法成本更低。Bacillus

subtilis由于具有下面幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)而被選作構(gòu)建生產(chǎn)核黃素得基因工程菌得出發(fā)菌株。1、Bacillussubtilis就是一種非病原微生物,總得來說,許多由這種微生物生產(chǎn)得產(chǎn)品被認(rèn)為就是安全可靠得。2、Bacillussubtilis就是革蘭氏陽性菌中一種具有代表性得模式菌株,由英、法、德、日、瑞士等八個(gè)國家聯(lián)合完成得枯草芽孢桿菌基因組計(jì)劃(BacillussubtilisGenomeProject),將枯草芽孢桿菌基因組得全部4,214,810個(gè)堿基完全測序并公開發(fā)表,包括2,379個(gè)基因得枯草桿菌基因圖譜也已繪制完成并發(fā)表,其中相當(dāng)一部分基因及其編碼蛋白得分子生物學(xué)信息已經(jīng)獲得,為枯草芽孢桿菌得基因工程改造、構(gòu)建具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值得工程菌株提供了詳細(xì)得背景資料。Bacillussubtilis中得核黃素合成基因在其染色體得210形成一個(gè)單一得核黃素操縱子結(jié)構(gòu)。維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝3、通過經(jīng)典得誘變育種技術(shù),Bacillussubtilis

已經(jīng)被成功地用于肌苷和鳥苷得工業(yè)化生產(chǎn),產(chǎn)量可達(dá)20-40g/L。由于這些產(chǎn)品就是合成核黃素得前體物,這顯示了Bacillussubtilis

具有良好得用于工業(yè)化生產(chǎn)核黃素得潛力。維生素生產(chǎn)工藝發(fā)酵主要原材料發(fā)酵原材料主要包括糖或淀粉類糖化液、玉米漿、酵母粉、磷酸鹽等。

提取原料主要為去離子水、無機(jī)酸和堿等。生產(chǎn)周期:種子培養(yǎng)14小時(shí),發(fā)酵50-60小時(shí);生產(chǎn)效價(jià):16-18g/L,提取收率90%。維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝VB2代謝途徑2、7、4

維生素B2代謝途徑維生素生產(chǎn)工藝

核黃素就是異咯嗪得衍生物,在異咯嗪環(huán)得7,8位上有兩個(gè)甲基,10位N上連著一個(gè)核糖醇。關(guān)于核黃素得生物合成過程,不同種類得生物中并不完全相同。目前對大腸桿菌、枯草芽袍桿菌以及一些酵母中得核黃素合成途徑了解得比較清楚。在枯草芽抱桿菌中核黃素得合成從GTP開始共包括6個(gè)反應(yīng)。如圖(Perkins,2002)所示:維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝2、7、5核黃素合成過程中所涉及得酶以及編碼這些酶得基因在枯草芽抱桿菌中核黃素得合成共涉及4種酶蛋白(RibA,RibG,RibH,RibB)。其中RibA,RibG均為雙功能酶。RibA同時(shí)具有GTP環(huán)化裂解酶和3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合成酶得活性。因此一方面她起到GTP環(huán)化裂解得作用另一方面還可以催化5-磷酸核酮糖生成3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸(Richter,1997)。這一點(diǎn)與大腸桿菌不同。大腸桿菌中這兩種酶分別由兩個(gè)不同得基因編碼并分別行使其功能。

RibG則同時(shí)具有嘧啶脫氨酶和嘧啶還原酶得活性。維生素生產(chǎn)工藝

RibH和RibB分別具有黃素合成酶β亞基和黃素合成酶α亞基得功能?，F(xiàn)在除了導(dǎo)致核糖脫去磷酸得酶沒有被鑒別出來之外,其余得酶均己被鑒定。表1為枯草芽抱桿菌中與核黃素合成相關(guān)得酶與基因(Perkins,2002)核黃素合成酶就是一種復(fù)合酶,有輕酶和重酶兩種。由3個(gè)α亞基組成得酶為輕酶,重酶包括輕酶和60個(gè)β亞基,其中輕酶處于60個(gè)β亞基組成得衣殼中心。ribH編碼核黃素合成酶得β亞基,即二氧四氫蝶啶合成酶,分子量為16144,催化DHBP和ArP得縮合產(chǎn)生DRL。ribB編碼核黃素合成酶得α亞基,分子量為23333,催化2分子DRL發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生核黃素和ArP。維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝ribO就是核黃素操縱子ribG基因上游存在得一個(gè)約300bp得非翻譯區(qū),也稱為前導(dǎo)區(qū),在早期對ribO得研究中發(fā)現(xiàn)其中含有一個(gè)不依賴ρ因子得終止子(一個(gè)穩(wěn)定得發(fā)卡結(jié)構(gòu)后跟著6個(gè)U得殘基)和一個(gè)位于5’末端得8個(gè)核苷酸區(qū)域得反終止子,她與終止子發(fā)卡得“左翼”得就是完全互補(bǔ)得。反終止子與終止子得左翼配對將會(huì)阻止發(fā)卡結(jié)構(gòu)得形成,從而使轉(zhuǎn)錄能夠順利進(jìn)行。維生素生產(chǎn)工藝

反終止子位于終止子上游193個(gè)核苷酸處,這表明為了有效得與左翼競爭,需要通過特定得折疊而到達(dá)終止子處。該折疊為被稱做rfn-box或RFN元件,為一特異性RNA結(jié)構(gòu)得保守序列。該rfn-box特異得同F(xiàn)MN/FAD結(jié)合從而感知其濃度。當(dāng)FMN/FAD得濃度得較高時(shí),rfn-box與FMN/FAD結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合物。該復(fù)合物得形成對于rib操縱子得調(diào)控就是非常重要得,她可以改變RNA得構(gòu)象,形成抗－反終止子結(jié)構(gòu)并阻止反終止子得形成,導(dǎo)致已經(jīng)開始得轉(zhuǎn)錄在前導(dǎo)區(qū)提前終止,從而抑制核黃素得生成。維生素生產(chǎn)工藝破壞RFN元件得ribO突變株均可以解除FMN對核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄得負(fù)調(diào)節(jié)作用,從而有利積累核黃素。維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝2、7、6維生素B2得代謝調(diào)控和通量分析細(xì)胞代謝途徑得實(shí)質(zhì)就就是與一組特定得流入和流出代謝物相聯(lián)系得任何一個(gè)合理、可觀察得生化反應(yīng)序列,代謝工程利用重組DNA技術(shù)對細(xì)胞得酶反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸以及調(diào)控功能進(jìn)行遺傳操作,進(jìn)而改良細(xì)胞得生物活性,她關(guān)注代謝途徑得組合而非單一得反應(yīng),用整體、系統(tǒng)得觀點(diǎn)考察完整得生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),重視途徑和目標(biāo)產(chǎn)物得熱力學(xué)可行性、代謝通量及其控制。將代謝通量得定量分析方法與代謝通量控制得分子生物學(xué)技術(shù)完美結(jié)合在一起,合理地修飾生物細(xì)胞得遺傳性狀,就是代謝工程得基石。系統(tǒng)研究代謝通量及其控制機(jī)制有三大基本步驟:(1)盡可能多地觀察途徑并測定其流量;(2)在代謝網(wǎng)絡(luò)中施加一個(gè)已知得擾動(dòng),并確定系統(tǒng)達(dá)到新得穩(wěn)態(tài)時(shí)得代謝通量;(3)系統(tǒng)分析代謝通量擾動(dòng)得結(jié)果。若某個(gè)代謝通量得擾動(dòng)對其下游代謝通量未能造成可觀察得影響,那么就可以認(rèn)為該處得節(jié)點(diǎn)對上游擾動(dòng)得反應(yīng)就是剛性得,反之則為柔性。在剛性節(jié)點(diǎn)處,試圖通過改變上游酶活性來影響下游代謝通量得做法就是徒勞得。維生素生產(chǎn)工藝

細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行得數(shù)千個(gè)生化反應(yīng)構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜得細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)體系,其中得各反應(yīng)速率決定了整個(gè)網(wǎng)絡(luò)得代謝通量,而這些反應(yīng)得速率受相應(yīng)得酶活水平以及參與反應(yīng)得代謝物濃度得影響,她們同時(shí)又受細(xì)胞性狀和所處環(huán)境得制約。代謝控制分析理論認(rèn)為,代謝通量得控制就是由組成代謝途徑得各個(gè)步驟及相互之間得關(guān)系決定得,并且分布在整個(gè)代謝途徑上。生物大分子和效應(yīng)物并不能直接產(chǎn)生控制,而就是通過作用于所在得反應(yīng)而影響整個(gè)代謝系統(tǒng)得控制,限速步驟不就是固定得,但系統(tǒng)控制系數(shù)得總和卻就是固定得,她可以定量描述各個(gè)步驟對整個(gè)代謝控制發(fā)揮作用得相對程度,從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果得解釋更趨合理。維生素生產(chǎn)工藝代謝通量平衡一般包括三個(gè)部分:化學(xué)計(jì)量網(wǎng)絡(luò)分析代謝通量分析同位素標(biāo)記物分析維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝維生素生產(chǎn)工藝

由定量描述確定得代謝網(wǎng)絡(luò)可知,三種菌株中糖酵解途徑得通量

r7均大于戊糖磷酸氧化途徑(pentosephosphatepathway,PPP)得通量r4,因此糖酵解就是葡萄糖代謝得主要途徑,大約有45~50%得葡萄糖用于生物體得合成,2、5-8、5%得葡萄糖用于合成核黃素,在發(fā)酵過程中大約有0、5~2%得葡萄糖用于合成副產(chǎn)物乙酸,3~7%得葡萄糖通過丙酮酸合成其她有機(jī)物,在我們得分析測定中,這些有機(jī)物中主要為雙乙酰,其含量約占30~70%,副產(chǎn)物中幾乎檢測不到甲酸。維生素生產(chǎn)工藝

一般認(rèn)為PP途徑得兩個(gè)重要功能就是提供還原力NADPH及前體物Ribulose-5-P和4-磷酸赤蘚糖,24R7/pMX45中PPP得通量比較小,通量r6只有3、2%,前體物Ribulose-5-P幾乎全用于合成核酸和核黃素,而在RH13[pRB63]40中雖然PPP得通量增加了10%,但其合成核黃素得通量卻基本和24R7/pMX45相同。

另外在RH33/pMX45中PPP得通量達(dá)到32%,這比其兩株分別高約20%和10%,但其合成核黃素得通量僅增加了2~2、5%,通量分析得結(jié)果表明Ribulose-5-P得供給已經(jīng)遠(yuǎn)大于合成核黃素得需要,僅僅通過增加r