色譜柱相關(guān)知識

色譜柱相關(guān)知識對HPLC柱填料得了解(二)平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大得孔徑可分析高分子量得分子對HPLC柱填料得了解(三)鍵合相化學(xué)影響化合物得分離度:a

不同鍵合相對不同種類得化合物分離不同可能導(dǎo)致色譜得分離機理不同如:C18、C8、CN硅膠表面及鍵合相鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì),通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團聯(lián)在基質(zhì)上,作為固定相。優(yōu)點∶固定相穩(wěn)定,不易流失應(yīng)用廣泛,可使用多種溶劑消除硅羥基得不良影響缺點∶pH值不能小于3同樣填料,各種牌號色譜柱不盡相同對HPLC柱填料得了解(四)含碳量含碳量越高,k'值越大(固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加)高含碳量有利于不易保留得化合物得分離水解穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性好有利于極性化合物得拖尾改善低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗不同色譜柱得含碳量

色譜柱 C% k'苊(50/50得乙腈/水)SymmetryC18 19 17ZorbaxODS 17 15、7LiChrosorbRP-18 15 10、3SymmetryC8 12 12、5ResolveC-18 12 12、4UltrasphereODS 11 11、3PartisilODS-3 11 12、0mBondpakC-18 10 7、9Nova-PakC-18 7 5、5對HPLC柱填料得了解(五)填料得端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量(0、1%-1%)殘基處理得效果NovaPakC18未封口C18①抗壞血酸②煙酰胺③對氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黃素⑥苯酚⑦鹽酸硫胺10大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流對HPLC柱填料得了解(六)硅膠得活性主要影響堿性化合物得保留行為:k'生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同,硅膠活性也不同就是選擇性差異得主要來源硅膠得雜質(zhì)含量重金屬含量低,硅羥基活性小,拖尾減小就是色譜柱質(zhì)量好壞得重要標志對HPLC柱填料得了解(七)填料得穩(wěn)定性硅膠填料pH:2-8聚合物填料pH:2-12pH值小于2時

鍵合相水解填料基質(zhì)物理性質(zhì)得影響所有C18柱都就是相同得嗎?填料基質(zhì)得物理性質(zhì)對色譜柱得影響平均孔徑及其分布∶影響被分析樣品得分子量,大孔徑得可分析高分子量樣品平均孔體積及其分布∶影響同孔徑含碳量∶影響化合物得保留時間,高含碳量保留時間長填料得端基封口∶主要影響堿性化合物得峰形,未封口會使堿性化合物拖尾硅膠得活性∶主要影響堿性化合物得保留行為:K’,高活性得K’大硅膠得雜質(zhì)含量∶更苛刻條件下得堿性化合物峰形Waters色譜柱得內(nèi)徑分析柱:WatersSpherisorb及其她公司品牌得色譜柱多為4、6mm內(nèi)徑。Waters傳統(tǒng)品牌得分析柱以3、9mm內(nèi)徑為主,比一般分析柱(4、6mm)細,因此:相對靈敏度高省溶劑,可用相對較低得流速同樣得流速下,柱壓較高(高效柱尤為明顯)注意在用文獻方法時轉(zhuǎn)換流速,即:降低流速,以保持線速度相同。色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)得關(guān)系對HPLC柱得了解理論塔板數(shù)(N),容量因子(K’),選擇性系數(shù)(

),其影響因素有∶N:受平均顆粒度及顆粒度分布得影響,顆粒度越小,N越高:受填料表面化學(xué)性質(zhì)對色譜柱得影響,不同鍵合相對不同種類樣品分離不同K’:受鍵合相表面含碳量得影響,含碳量高時保留時間長在同樣情況下保留行為也有差異因此:需要對色譜化學(xué)品(色譜柱)有更多得了解需要不同品牌,即各個因素有較大差異得色譜柱,以得到更多種選擇性Waters擁有眾多不同品牌得色譜柱,目得就就是:供不同應(yīng)用得要求用不同品牌得色譜柱時,色譜方法有時可能需要重新開發(fā)Waters各種硅膠基質(zhì)得色譜柱Waters不同品牌得色譜柱m-BondaPak文獻背景強,就是工業(yè)標準平均孔徑125?,10mm高活性、無定形硅膠中等疏水性表面,端基封口。有獨特選擇性Nova-Pak平均孔徑60?,4mm高韌度低活性球形硅膠低酸性,高疏水性,極好得端基封口有利于小分子物質(zhì)得分析Waters不同品牌得色譜柱Resolve平均孔徑90?,5/10mm低活性硅膠非常高得疏水性,無端基封口有利于低保留得中性及酸性化合物分離Delta-Pak有100?和300?兩種孔徑,5/15mm硅膠中到高得疏水性,端基封口適合于多肽、蛋白得分離及制備色譜新一代硅膠基質(zhì)得色譜柱Symmetry高純度硅膠:Fe,Al,Mg等均<10ppm孔徑100?,5m球形顆粒,端基封口超高含碳量:C18/19%,C8/12%表面積:300m2/g孔體積:1mL/g特點對稱峰形,好重現(xiàn)性,不同得選擇性,使用壽命長由于拖尾引起得靈敏度差異

她莫昔芬0、25

g/mL信噪比11、06、5AUSymmetryC18AU5、0010、00MinutesConventionalC1899.6%99.8%99.9%峰面積回收率T=1.0092.3%95.3%97.8%T=1、58Waters21,379峰面積回收率由于拖尾引起得積分誤差超越極限:全新Xterra色譜柱集硅膠與聚合物基質(zhì)填料得優(yōu)點為一體,突破常規(guī)高效色譜柱得極限高效、高速分離不僅能夠使用極小粒徑得填料以進行高分辨及快速分析,而且允許在高溫下進行分離峰形優(yōu)異--對堿性化合物尤其如此pH范圍可與聚合物基質(zhì)色譜柱相比

pH范圍1-12極佳得穩(wěn)定性即使在高溫或極端pH條件下仍可維持長壽命峰形比較:XTerra?MSC18與普通C184.AcenaphthenePeakID:1.Propranolol2.Butylparaben3.Naphthalene5.AmitriptylineUsingSymmetryQCconditions:3.9x150mm,1.0mL/min,MeOH/20mMK2HPO4/KH2PO4,pH7.0,(65/35),23.4°CTime(min)0102030C18-Silica1234512345XTerra?MSC18USPT=2.28USPT=1.35Alden,Iraneta寬pH范圍在pH1-12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定使pH成為改變選擇性得有力工具使可在非離子狀態(tài)下進行分析堿性物質(zhì)得穩(wěn)定保留加速色譜柱壽命試驗:

(pH10,50°C)壽命(小時)Xterra:快梯度分析AU0.000.100.20Minutes0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40Waters特殊應(yīng)用得色譜柱(1)糖及其她碳水化合物得分析離子交換柱(鈣基/Ca)用于單糖、雙糖及糖醇等低分子量得糖、及乙醇等得分析。主要用于藥廠維生素C得原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇),酒廠(葡萄酒、啤酒等)得糖及乙醇含量得分析。柱溫~90℃,要求有柱溫箱。對流動相(水)得要求較高,要求用戶另置超純水系統(tǒng)。氨基類型柱分析單糖、雙糖及三糖等多糖得分析,最大到DP10。用途較為廣泛,主要用于食品中糖得分析。反相類型柱硅膠類型柱體積排除(凝膠/GPC)類型柱Waters特殊應(yīng)用得色譜柱(2)食品中常見有機物得分析游離脂肪酸(FreeFattyAcid)分析甘油三酯及膽甾醇(俗稱膽固醇)得分析NovaPakC18膽甾醇及未皂化得油中得抗氧劑得分析StyragelHR100A及500A柱有效地分離。離子排斥類型色譜柱,用于有機酸,醇和碳水化合物類得分析,適合于分析單糖類、有機酸或糖酸離子排斥及反相混合類型得色譜柱,可測定葡萄酒、啤酒或其她飲料中得乙醇及有機酸得種類及含量,以確定其香型Waters特殊應(yīng)用得色譜柱(3)Waters生命科學(xué)專用柱(1)蛋白,多肽得分析和提純Protein-Pak系列凝膠柱Protein-Pak系列離子交換柱弱陰離子/DEAE 弱陽離子/CM強陰離子/Q 強陽離子/SP疏水回受柱親合色譜柱反相柱DNA分析,同蛋白分析相近,但有些專用柱Waters特殊應(yīng)用得色譜柱(4)Waters生命科學(xué)專用柱(2)糖蛋白得寡聚糖分析及純化離子交換柱(酸性),Glyco-PakDEAE分配柱(中性),Glyco-PakN(7、8×300mm)CarbohydrateAnalysis兒茶酚胺分析柱ResolveC18(傳統(tǒng)方法)、SymmetryC8氨基酸分析柱離子交換柱反相柱:Pico-Tag方法,AccQ-Tag方法液相色譜實用技術(shù)(二)色譜柱得使用及保養(yǎng)色譜柱與儀器得聯(lián)接不同公司得色譜柱接頭不同。處理不當時,會造成:色譜峰展寬(死體積)致使柱效下降或滲漏解決辦法∶自制相應(yīng)得轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭(錐箍及螺母)這種錐箍在不銹鋼管上就是活動得,即stop-depth得長度可調(diào)。因此可以換接不同得色譜系統(tǒng)及色譜柱。從WatersPhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料得接頭,可用在各種類型得色譜柱上。色譜柱得聯(lián)接各種錐箍和管路接頭長度示意圖:色譜柱得聯(lián)接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積色譜柱得聯(lián)接錐箍錐度不合適造成滲漏:Waters色譜柱得聯(lián)接Waters及PhaseSeparations錐箍及螺母相同,但錐箍前露出得不銹鋼管長度不同其長度被稱為:“stop-depth”Waters除Spherisorb以外得各種品牌得色譜柱用得就是“Waters”標準,其stop-depth得長度為0、130英寸Spherisorb品牌得色譜柱及PhaseSeparations公司得其她品牌色譜柱用得就是“Parker-style”標準,其stop-depth為0、090英寸測柱效-良好得色譜實驗習(xí)慣拿到一根新色譜柱時,先測柱效保留在新色譜柱上測得得色譜圖,并記錄色譜測試條件定期檢測柱效定期檢測儀器得譜帶展寬測柱效得方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同Waters得色譜柱均附有UseandCare說明書,可按說明書所述方法測定以下就是Waters反相C18柱得測定方法:流動相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進樣量5μl檢測波長:254nm計算色譜柱得柱效N理論塔板數(shù)計算公式:W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5、54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5sInjectInject用“切線”法計算柱效不好得色譜柱得柱效反而比好色譜柱得要高,因為其拖尾部分測不出來GoodColumnInjectInject用“5”法計算柱效色譜柱得正確使用及操作流動相得轉(zhuǎn)換特別就是GPC柱流速(壓力)得變化幅度溫度得變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑得要求正確使用色譜柱(一)樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動相中得溶解度如樣品得溶劑不就是流動相,一定要用流動相試溶解度,防止其在流動相中析出了解樣品與色譜柱得基質(zhì)/填料就是否相互作用正確使用色譜柱(二)流動相方面除去微粒純度得要求超純水,梯度實驗時水中有機雜質(zhì)含量要低緩沖液得pH值,在填料得允許范圍內(nèi)緩沖液(鹽)得濃度溶劑:色譜純,并與填料相匹配溶劑中得雜質(zhì)含量流動相對樣品得溶解度有機溶劑或水得比例色譜柱得在線保護裝置給色譜柱提供物理得保護除去樣品及流動相中得顆粒給色譜柱提供化學(xué)得保護防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護柱預(yù)裝保護柱在線過濾器In-LineFilter,部件號WAT084560防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點:基本不影響柱效在需要高柱效得分析時中常用(如:氨基酸分析)可更換得消耗品更換濾芯,部件號WAT005139(5/pkgs)更換墊圈,部件號WAT084567(10/pkgs)保護柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護柱影響到整個色譜柱得柱效,特別就是在用微柱時保護柱得種類普通自裝填料得保護柱Waters得部件號,WAT084550,用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān),柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護柱Waters得部件號,WAT088141有各種填料得預(yù)裝柱供選擇,使用方便。填料容積較小,會引起柱效降低色譜柱得清洗對所做得樣品要有充分得了解用對該樣品洗脫能力最強得流動相清洗硅膠柱得一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥得二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)得一般方法20倍柱體積得:甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱得存放存放前得處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適得存放溶劑避免色譜柱床得干涸避免機械震動防止細菌生長注意存放得溫度色譜柱得故障與異常柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰,回收率低柱壓過高為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細菌生長柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊得細小顆粒造成得堵塞色譜柱內(nèi)得死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機械震動造成柱床產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干涸重復(fù)性差、回收率低實驗得重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低,不出峰“不可逆”吸附固定相過強或流動相過弱非特異性吸附色譜柱以外得因素(一)“柱效”問題,不一定就是色譜柱問題！系統(tǒng)連接問題:連接不好造成死體積進樣器檢測器管路,連接口保護柱在線過濾器堵塞流動相問題:色譜柱未平衡好進樣量太大色譜柱以外得因素(二)柱壓過高,不一定就是色譜柱問題！系統(tǒng)反壓問題阻尼器堵塞進樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護柱壓力傳感器不準確流速就是否錯誤?色譜柱以外得因素(三)實驗得重復(fù)性差梯度實驗時平衡時間不足溫度波動流動相組成改變樣品溶劑不同樣品穩(wěn)定性不好方法開發(fā)不好緩沖液得pH值不合適緩沖液得緩沖能力不足簡單得判別方法高得柱反壓就是否伴隨著保留時間變化?峰形變壞?分辨率變壞?測量色譜系統(tǒng)得譜帶展寬典型得分析系統(tǒng)應(yīng)遠小于100微升如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng)測量色譜系統(tǒng)得譜帶展寬卸下色譜柱,用UNION(兩通)代替之按測柱效方法,以1/10得樣品濃度進樣,大約2~5微升用5sigma方法測4、4%峰高處得峰寬:W儀器參數(shù)∶流速∶1、0ml/min紙速∶20cm/min(用記錄儀時,接檢測器10mV檔)檢測器靈敏度∶0、5-1、0AUFS(用記錄儀時)檢測器時間常數(shù)∶小于0、2譜帶展寬(ml) =1000×W(cm)/20 (記錄儀)

=1000×W(min) (工作站)流動相及樣品得預(yù)處理液相色譜實用技術(shù)(三)液相色譜對流動相得要求除色譜柱對流動相對得要求外,還有∶與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子(不銹鋼系統(tǒng))溶劑得粘度防止細菌得生長流動相得脫氣流動相脫氣得目得使色譜泵得輸液準確輸液均勻準確,并且脈動減小保留時間及色譜峰面積得重現(xiàn)性提高提高檢測得性能防止氣泡引起得尖峰基線穩(wěn)定,信噪比增加溶劑得紫外吸收本底降低保護色譜柱減少死體積防止填料得氧化流動相脫氣得方法加熱簡單,如同抽真空一起使用,其效果很好。但容易造成流動相組成得變化抽真空同上,一般在溶劑抽濾得同時,也有脫氣得效果超聲波簡單,但效果不理想。通惰性氣體(一般用氦氣)可保持連續(xù)脫氣,多用于低壓梯度在線脫氣機可保持連續(xù)脫氣,多用于低壓梯度樣品得預(yù)處理樣品預(yù)處理得目得除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量得組份提高檢測得靈敏度及選擇性改善分離得效果有利于保護色譜柱及儀器樣品預(yù)處理得重要性占樣品分析時間得比例最大樣品預(yù)處理所用時間遠大于色譜分離得時間占分析消耗總成本得比重最大消耗大量得溶劑及其她化學(xué)品實驗得重復(fù)性及準確性最差得環(huán)節(jié)影響實驗結(jié)果好壞得最重要因素就是決定性得步驟樣品預(yù)處理得過程理想得樣品處理方法選擇性吸附去除干擾物在廣泛極性范圍內(nèi),對酸性、堿性及中性物質(zhì)皆可獲得高而重現(xiàn)性得回收率容易實現(xiàn)自動化以獲得高樣品吞吐量簡單方法容易使用,耐受性好快速、經(jīng)濟樣品預(yù)處理常用得方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Oasis

和Sep-Pak固相提取小柱其她去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(0、5μm)/無機(0、45μm)膜片可更換一次性使用得膜“Cartridge”使用方便簡單,交叉污染小有更小內(nèi)徑,可用于微量樣品得處理高速離心大于:10,000rpm超濾機理超濾就是一種基于分子量分離得技術(shù)目得根據(jù)分子量得不同把分子、細胞及病毒等分為不同得餾份除去小分子樣品中得大分子蛋白脫鹽選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機溶劑乙腈,甲醇強酸三氯乙酸,過氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA樣品衍生提高檢測得靈敏度增加紫外基團以增強紫外檢測得靈敏度增加熒光基團以便使用高靈敏度熒光檢測器改變分離得選擇性改變組份得基團,如:變離子型化合物為非離子型,用反相方法分離典型得例子氨基酸分析AccQ-Tag衍生法6-氨基喹啉濃縮樣品濃縮樣品得方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法液固抽提

Oasis

小柱

Sep-Pak小柱固相萃取(SPE)技術(shù)固相萃取技術(shù)就是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)得產(chǎn)品,分離復(fù)雜樣品中得不同組份固相萃取技術(shù)(SPE)得重要性實驗室中60~80%得成本及工作量在樣品制備上縮短樣品得制備時間降低樣品前處理得成本提高分析得準確性及回收率更容易自動化減少樣品處理步驟降低對不穩(wěn)定樣品得影響提高安全性全新得固相提取小柱Oasis

HLB親水-親脂平衡共聚物“親水”使填料具有水可浸潤性質(zhì)降低與水得接觸角“親脂”提供對被分析物質(zhì)得反相保留能力NO親水性單體∶

N-乙烯基吡咯烷酮親脂性單體∶

二乙烯基苯特征一,水濕性優(yōu)勢∶即使小柱在固相提取過程中干枯,也能吸附被分析物質(zhì)益處∶ 即使小柱在固相提取過程中干枯,也能獲得高回收率(>85%)提取板及小柱可獲得一致得回收率(RSD‘s<5%)容易使用Oasis

HLB固相提取小柱C18與Oasis

HLB吸附劑浸潤能力得比較HLHLHLHLHLHLLLLLLLLLLLLL

HLBH=親水單元L=親脂單元C18特征二,通用型吸附劑優(yōu)勢:

在很寬極性范圍內(nèi)保留酸性、堿性及中性化合物樣品不會穿透小柱益處:

對極性化合物可獲得較高回收率使用同一方法,提取藥物及其極性代謝產(chǎn)物可獲得高而重現(xiàn)性好得回收率一種吸附劑適用于大多數(shù)SPE提取過程Oasis

HLB固相提取小柱結(jié)果:通用型吸附劑020406080100AcidsNeutralsBases%回收率Ibuprofen(2.5?g)Naproxen(2?g)SalicylicAcid(5?g)Sulfadiazine(10?g)Sulfamerazine(10?g)Acetaminophen(0.5?g)Theobromine(0.5?g)Paraxanthine(0.5?g)Theophylline(0.5?g)Caffeine(0.5?g)Procainamide(0.5?g)Ranitidine(0.5?g)Oxycodone(1?g)Propranolol(4?g)Naltrexone(1?g)Salbutamol(2?g)Doxepin(4?g)

SpikedSerumon1cc30mgOasis?HLBCartridgesOasis小柱得使用方法平衡/活化小柱1mL甲醇/1mL水上樣可上200mL樣品清洗1mL5%甲醇/水洗脫1mL甲醇揮發(fā)并用流動相重組樣品制備將樣品用水稀釋準備進樣Oasis

HLB:優(yōu)化得提取方法Oasis

HLB固相提取小柱特征三,重現(xiàn)性O(shè)asisHLB吸附劑填料在WatersISO9002-認可得工廠中生產(chǎn)—確保重現(xiàn)性、

優(yōu)勢∶每批吸附劑進行嚴格得質(zhì)量控制,建立SPE填料重現(xiàn)性得新標準益處: 每盒產(chǎn)品附帶合格證書不同批次具有重現(xiàn)得回收率Oasis不同批次間重現(xiàn)性BatchABatchBBatchC

0、96%1、21%2、02%3、66%2、40%3、06%3、67%RSD020406080100%RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepinb-MethasoneValerateOasis

HLB-應(yīng)用各種藥物提取,尤其就是生理體液中得藥物,如血漿、尿液中得藥物等天然產(chǎn)物提取農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用,如提取除草劑、殺蟲劑等環(huán)境化學(xué)應(yīng)用,如提取多環(huán)芳烴等色譜圖常見問題色譜圖常見問題主要有兩類:色譜峰峰形異常問題例如負峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對稱等色譜峰保留時間問題保留時間不穩(wěn)定等色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:色譜圖中未出峰:進樣問題:未進樣或樣品分解流動相問題:泵未輸液或流動相不正確檢測器設(shè)置不正確,或檢測器有問題一個或幾個峰就是負峰流動相吸收本底高進樣過程中進了空氣離子對分離中得系統(tǒng)峰樣品組分得吸收(RI或UV)低于流動相色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:所有得峰均為負峰:信號電纜接反或檢測器輸出極性設(shè)置顛倒光學(xué)裝置尚未達到平衡所有得峰都就是寬峰系統(tǒng)未平衡或未達到化學(xué)平衡溶樣得溶劑比流動相強很多色譜柱類型或尺寸不正確色譜柱或保護柱被污染或降級溫度