實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鼠痘病毒檢測(cè)方法 征求意見(jiàn)稿

2GB/T14926.20—202X實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠痘病毒檢測(cè)方法本文件規(guī)定了鼠痘病毒（EctromeliaVirus,ECTV）的檢測(cè)方法。本文件適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠痘病毒的檢測(cè)，或?qū)嶒?yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)鼠環(huán)境和鼠源性生物制品中鼠痘病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.50實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)GB/T14926.51實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫酶試驗(yàn)GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫熒光試驗(yàn)GB/T14926.55實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫酶組織化學(xué)法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T4918-2017《鼠痘檢疫技術(shù)規(guī)范》3原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）/免疫酶試驗(yàn)（IEA采用ECTV抗原檢測(cè)鼠血清中ECTV抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的酶標(biāo)二抗結(jié)合，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。顏色反應(yīng)的深淺與待檢血清中所含有的ECTV抗體的量成正比。免疫熒光試驗(yàn)（IFA）：采用ECTV抗原檢測(cè)鼠血清中ECTV抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合，在紫外光或藍(lán)紫光的照射下，激發(fā)出可見(jiàn)的熒光，在熒光顯微鏡下以熒光的有無(wú)和強(qiáng)弱判定結(jié)果。3GB/T14926.20—202X免疫酶組織化學(xué)法（IH采用已知的ECTV特異性抗體與標(biāo)本中待測(cè)抗原反應(yīng)，如待測(cè)抗原是特異性抗體的相應(yīng)抗原則形成抗原抗體復(fù)合物。此抗原抗體復(fù)合物仍保持其抗原活性，可與相應(yīng)的第二抗體酶結(jié)合物結(jié)合，遇酶底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。在普通顯微鏡下，根據(jù)顏色的反應(yīng)判定結(jié)果。核酸檢測(cè)：根據(jù)鼠痘病毒保守序列基因，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物和一條特異性探針序列，提取樣本中的鼠痘病毒DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果判定該樣品中是否含有病毒核酸成分。4主要試劑和器材4.1主要試劑4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原用ECTV感染BHK21細(xì)胞，當(dāng)病變達(dá)+++~++++時(shí)收獲。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成EIASA抗原。4.1.1.2正常抗原BHK21細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片ECTV感染BHK21細(xì)胞，接種后2~3d，病變達(dá)++~+++時(shí)用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。4.1.3陽(yáng)性血清用滅活ECTV抗原，免疫SPF小鼠所獲得的抗血清。4.1.4陰性血清SPF小鼠血清。4.1.5酶結(jié)合物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊或兔抗小鼠IgG抗體；或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A。4.1.6熒光標(biāo)記物異硫佩酸熒光素標(biāo)記羊或兔抗小鼠IgG抗體。4GB/T14926.20—202X4.1.7引物和探針表1實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物和探針注：探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同檢測(cè)效果的其他合適的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基4.1儀器與器材4.2.1酶標(biāo)儀。4.2.2熒光顯微鏡。4.2.3普通顯微鏡。4.2.437℃培養(yǎng)箱或水浴箱。4.2.5石蠟切片機(jī)或冷凍切片機(jī)。4.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。5檢測(cè)方法5.1生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。5.2實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求和檢驗(yàn)質(zhì)量控制的基本要求參考GB/T19495.2的規(guī)定。5.3采樣及樣本的處理采樣及樣本處理見(jiàn)本文件附錄A，采樣過(guò)程中樣本不得交叉污染，采樣及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中須戴一次性手套。5.4采用ELISA方法（見(jiàn)GB/T14926.50）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或按照等效商業(yè)化ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。5.5采用IFA方法（見(jiàn)GB/T14926.52）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或按照等效商業(yè)化IFA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。5GB/T14926.20—202X5.6采用IEA方法（見(jiàn)GB/T14926.51）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或按照等效商業(yè)化IEA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。5.7采用IH法（見(jiàn)GB/T14926.55）進(jìn)行病毒抗原檢測(cè)，或按照等效商業(yè)化IH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。5.8采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法（見(jiàn)附錄A）進(jìn)行核酸檢測(cè)，或按照等效商業(yè)化實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。6結(jié)果判定6.1ELISA/IFA/IEA對(duì)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，選用同一種方法或另一種方法重試。如仍為陽(yáng)性則判為陽(yáng)性。6.2IH對(duì)照片本底清晰，背景無(wú)非特異著染，被檢物呈黃至徐褐色著染，即可判為陽(yáng)性。6.3實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判定對(duì)陽(yáng)性或可疑結(jié)果，用同一種方法重試。如仍為陽(yáng)性或可疑，則判為陽(yáng)性。7結(jié)果報(bào)告根據(jù)判定結(jié)果，出具報(bào)告。6GB/T14926.20—202X（規(guī)范性附錄）鼠痘病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法A.1主要設(shè)備和材料A.1.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。A.1.2Nanodrop紫外分光光度計(jì)。A.1.3高速冷凍離心機(jī)。A.1.4臺(tái)式離心機(jī)。A.1.5恒溫孵育器。A.1.6漩渦振蕩器。A.1.7組織勻漿器或手持式均質(zhì)器。A.1.8生物安全柜。A.1.9PCR工作臺(tái)。A.1.102-8℃冰箱，-20℃冰箱，2-8℃冰箱。A.1.11微量移液器（10μL，100μL，1000μLA.1.12無(wú)RNase和DNase污染的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），無(wú)RNase和DNase污染的吸頭（10μL，200μL，1mL），無(wú)RNase和DNase污染的PCR擴(kuò)增反應(yīng)管。A.1.13采樣工具：剪刀、鑷子、注射器等。A.2試劑除特別說(shuō)明外，以下實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。A.2.1無(wú)DNase/RNase去離子水實(shí)驗(yàn)用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過(guò)夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒或等效試劑盒。A.2.3引物和探針：根據(jù)表1的序列合成引物和探針，引物和探針加無(wú)RNase去離子水分別配制成20μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。A.3樣本的采集、處理和存放A.3.1動(dòng)物相關(guān)樣本和臟器組織活體動(dòng)物可采集疑似病變部位的拭子、痂皮等樣本裝入無(wú)菌離心管中編號(hào)備用。也可將動(dòng)物安樂(lè)死后無(wú)菌采集動(dòng)物的肝臟、脾臟、疑似病變皮膚組織等相關(guān)臟器，剪取待檢樣品1.07GB/T14926.20—202Xg于無(wú)菌5mL離心管，加入4mL滅菌PBS，使用電動(dòng)勻漿器充分勻漿1~2min，然后將組織懸液在4℃、3000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.3.2盲腸內(nèi)容物或糞便無(wú)菌采集取約1g的盲腸內(nèi)容物或1~2顆糞便置于無(wú)菌5mL離心管，加入4mL滅菌PBS，使用電動(dòng)勻漿器充分勻漿1~2min，12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.3.3細(xì)胞培養(yǎng)物方法一：直接刮取樣品接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物于15mL離心管中，3000r/min離心10min，去上清，加1mL滅菌PBS重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5mL離心管中，編號(hào)備用。方法二：將樣品接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15mL離心管中，編號(hào)備用。A.3.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境A.3.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料、墊料和飲水取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料和墊料置于無(wú)菌容器中，加入適量滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4℃,12,000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.3.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備使用適當(dāng)?shù)牟蓸庸ぞ呤萌?shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施出風(fēng)口濾膜上的沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.3.5樣本的存放采集或處理的樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。A.4樣本DNA提取A.4.1取50~100μL的樣本至1.5mL或2mL離心管中，加20μL蛋白酶K，用PBS補(bǔ)加至220μL。A.4.2加入200μL緩沖液AL，渦旋震蕩充分混勻，56℃孵育10min。8GB/T14926.20—202XA.4.3加入200μL的無(wú)水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。A.4.4移取步驟C.1.3的混合液至離心柱上，離心柱放在2mL收集管上。≧6000g（8000r/min）離心1min。棄收集管/液。A.4.5離心柱放至新的2mL收集管上，加500μL的緩沖液AW1，≧6000g（8000r/min）離心1min。棄收集管/液。A.4.6離心柱放至新的2mL收集管上，加500μL的緩沖液AW2，20000g（14000r/min）離心3min。棄收集管/液。A.4.7將離心柱放在一個(gè)新的1.5mL離心管上，吸取200μL的緩沖液AE在吸附膜上，室溫孵育1min，≧6000g（8000r/min）離心1min。制備好的DNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)；若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。DNA提取試劑盒進(jìn)行，提取方法可進(jìn)行A.5實(shí)時(shí)熒光PCRA.5.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分用量/μL終濃度PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)PCRForwardPrimer(10μM)0.40.2μMPCRReversePrimer(10μM)0.40.2μMProbe(5μM)0.8RoxReferenceDye(50×)0.4DNA模板2滅菌水620A.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表3。試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)9GB/T14926.20—202X表3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)步驟溫度循環(huán)數(shù)采集熒光信號(hào)預(yù)變性95℃30s1否變性95℃40否退火，延伸60℃31s是b）可使用其他等效的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相A.5.3實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判定A.5.3.1結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。A.5.3.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，一直為水平線。陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，一直為水平線。陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)≤35，并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。A.