實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肺炎病毒檢測(cè)方法 征求意見稿

本文件規(guī)定了小鼠肺炎病毒（PVM）的檢測(cè)方法。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。根據(jù)免疫學(xué)原理，采用PVM抗原檢測(cè)小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中PVM抗體。4.1試劑:PVM感染小鼠待發(fā)病后取肺臟，研磨，制成10%懸液，3000r/min離心10min后取上清液感染處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。BHK21細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。PVM免疫清潔或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠所獲得的抗血清。辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A(SPA)可用于小鼠、豚鼠、地鼠血清抗體的檢查。表1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增引物和探針GCAAGGACACTCGGCATGTTGGAGCCCTATTTCTGCCACFAM-CTTACTTACTGCCTTCAACCGTTGCGAAGA-BHQ-1714.2器材5.4采用熒光定量PCR方法（見附錄A）進(jìn)行核酸檢測(cè)。則判為PVM抗體陽性。典型擴(kuò)增曲線，判為可疑，需復(fù)檢，復(fù)檢仍出現(xiàn)35＜Ct值≤40，并且曲線有明顯的對(duì)數(shù)為陽性；否則判為陰性。無Ct值或Ct值＞40且無特征性擴(kuò)增曲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肺炎病毒核酸檢測(cè)方法A.1主要設(shè)備和材料A.1.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀A.1.2Nanodrop紫外分光光度計(jì)。A.1.3高速冷凍離心機(jī)A.1.4臺(tái)式離心機(jī)。A.1.5恒溫孵育器。A.1.6漩渦振蕩器。A.1.7組織勻漿器或手持式均質(zhì)器。A.1.8生物安全柜。A.1.9PCR工作臺(tái)。A.1.10-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.11微量移液器（10μL，100μL，100A.1.12無RNase和DNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），無RNase和DNase的吸頭（10μL，200μL，1mL），無RNase和DNase的PCR擴(kuò)增反應(yīng)管。A.2試劑A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL去離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2無DNase/RNase去離子水實(shí)驗(yàn)用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.3RNA抽提試劑TRIzol或其他等效產(chǎn)品。A.2.4無水乙醇。A.2.575%乙醇（無DNase/RNase去離子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7異丙醇。A.2.8引物和探針：根據(jù)表1的序列合成引物和探針，引物和探針加無RNase去離子水分別配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。A.3樣本的采集A.3.1臟器組織將活體動(dòng)物安樂死后剖檢，無菌采集動(dòng)物的肺、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、或脾臟，剪取待檢樣品2.0g于無菌離心管。A.3.2盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣品2.0g于無菌離心管中。A.3.3實(shí)驗(yàn)接種物直接取待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤組織等待測(cè)實(shí)驗(yàn)接種物于無菌離心管中。A.3.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料和墊料置于無菌樣品袋中；取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；用無菌拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物籠具出風(fēng)口初效濾膜表面粉塵裝入無菌離心管中；取籠具系統(tǒng)內(nèi)置的出風(fēng)口粉塵吸附介質(zhì)裝入無菌離心管中；用無菌拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境中的待測(cè)位置后裝入無菌離心管中。A3.5樣本的運(yùn)輸和存放樣本采集后應(yīng)密封、加冰并盡快運(yùn)送到檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。在2~8℃條件下暫存應(yīng)不超過24h，若不能立即檢測(cè)應(yīng)-20℃保存，若需長(zhǎng)期保存，須置于-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。A.4樣本RNA提取使用TRIzol或其他等效產(chǎn)品提取RNA，TRIzol對(duì)人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。A.4.1取200μL處理后的樣本加1mLTRIzol后，充分混勻，室溫靜置10min使其充分裂解。A.4.2按每毫升TRIzol加入200μL氯仿，蓋緊樣本管蓋，用手用力振蕩搖晃離心管15s；不應(yīng)用漩渦振蕩器，以免基因組RNA斷裂。室溫靜置5min。4℃、12A.4.3離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA存在于水樣層當(dāng)中，水樣層的容量大約為所加TRIzol容量的60%。吸取上層水相至另一離心管中，注意不要吸取中間界面。A.4.4按每毫升TRIzol加入0.5mL異丙醇異丙醇混勻，室溫放置10min。4℃12000r/min離心10min，棄上清，RNA沉淀一般形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。A.4.5按每毫升TRIzol加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃7500r/min離心5min，棄上清，將離心管倒立吸水紙上，盡量使液體流干。A.4.6室溫自然風(fēng)干干燥5~10min，RNA樣本不要過于干燥。A.4.7用50~100μL無RNase去離子水溶解RNA樣品，制備好的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)；若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.5實(shí)時(shí)熒光RT-PCR實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系見表6。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。1)反應(yīng)體系見表2?？傮w系50μL。表2：熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制表反應(yīng)組份用量/μL終濃度2×OneStepRT-PCRBufferⅢ25ExTagHS(5U/μL)1/PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ1/ForwardPrimer(10μM)2.5500nMReversePrimer(10μM)2.5500nMProbe(5μM)2250nMRox1/TotalRNA/無RNase去離子水5/實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見表3。表3：熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)表步驟溫度采集熒光信號(hào)循環(huán)數(shù)逆轉(zhuǎn)錄42℃5min否1預(yù)變性95℃30sec否1變性95℃5sec否退火，延伸60℃34sec是40相應(yīng)調(diào)整。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。A.5.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR結(jié)果判定直接讀取檢測(cè)結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照無Ct值，且無熒光擴(kuò)增曲線，一直為水平線；陰性對(duì)照無Ct值，且無熒光擴(kuò)增曲線，一直為水平線；陽性對(duì)照Ct值≤35，且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則滿足質(zhì)控要求；否則此次試驗(yàn)無效，需重測(cè)。A.5.3.1質(zhì)控成立條件下，若待檢測(cè)樣本無熒光擴(kuò)增曲線，則判定為陰性。A.5.3.2質(zhì)控成立條件下，若待檢測(cè)樣本有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35