實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠細(xì)小病毒檢驗(yàn)方法 征求意見稿

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠細(xì)小病毒檢測(cè)方法本文件規(guī)定了小鼠細(xì)小病毒（MVM）的檢測(cè)方法和試劑等。本文件適用于小鼠細(xì)小病毒的檢測(cè)，或?qū)嶒?yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本和動(dòng)物源性生物制品中小鼠細(xì)小病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.42實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集GB/T14926.50實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)GB/T14926.51實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫酶試驗(yàn)GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫熒光試驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）/免疫酶試驗(yàn)（IEA根據(jù)免疫學(xué)原理，采用MVM抗原檢測(cè)小鼠血清中MVM抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的酶標(biāo)二抗結(jié)合，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。顏色反應(yīng)的深淺與待檢血清中所含有的MVM抗體的量成正比。免疫熒光試驗(yàn)（IFA采用MVM抗原檢測(cè)小鼠血清中MVM抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合，在紫外光或藍(lán)紫光的照射下，激發(fā)出可見的熒光，在熒光顯微鏡下以熒光的有無(wú)和強(qiáng)弱判定結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)：提取自樣本的病毒DNA，通過(guò)針對(duì)MVM的特異性引物和探針，在DNA聚合酶作用下，經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，進(jìn)行特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣品中是否含有MVM核酸。4主要試劑與器材4.1主要試劑4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原MVM接種敏感細(xì)胞（如小鼠胚（ME）細(xì)胞、3T3細(xì)胞等），培養(yǎng)7～10d，病變達(dá)+++~++++時(shí)收獲。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.1.2正常抗原未接種MVM的正常培養(yǎng)細(xì)胞（如ME細(xì)胞、3T3細(xì)胞等）凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片MVM接種敏感細(xì)胞（如大鼠胚（RE）細(xì)胞、ME細(xì)胞等培養(yǎng)7～10d，病變達(dá)++～+++時(shí)用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。4.1.3陽(yáng)性血清MVM抗原免疫SPF小鼠所獲得的抗血清。4.1.4陰性血清SPF小鼠血清。4.1.5酶結(jié)合物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊或兔抗小鼠IgG抗體；或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A4.1.6熒光結(jié)合物異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊或兔抗小鼠IgG抗體4.1.7核酸提取試劑盒。4.1.8探針法熒光PCRMIX預(yù)混液。4.1.9qPCR陰性對(duì)照不含有MVMDNA的樣本（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）4.1.10qPCR陽(yáng)性對(duì)照含有MVM的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物的樣本4.1.11引物和探針根據(jù)序列（見表1）合成引物和探針，引物和探針加入滅菌去離子水配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。**探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同效果的其他合適熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)組合。4.2主要器材4.2.137℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱4.2.2酶標(biāo)儀4.2.3普通顯微鏡和熒光顯微鏡4.2.4生物安全柜4.2.5實(shí)時(shí)熒光PCR儀4.2.6渦旋振蕩器5檢測(cè)方法5.1生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。5.2實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求和檢驗(yàn)質(zhì)量控制的基本要求參考GB/T19495.2的規(guī)定。5.3樣本采集及處理檢測(cè)步驟5.3.1血清采集參照GB/T14926.424.3血清采樣。5.3.2臟器組織、盲腸內(nèi)容物或糞便、實(shí)驗(yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本等的采集參見附錄A。5.4采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進(jìn)行檢測(cè)，或使用驗(yàn)證合格的等效試劑盒檢測(cè)。5.5采用IEA方法（見GB/T14926.51）進(jìn)行檢測(cè)，或使用驗(yàn)證合格的等效試劑盒檢測(cè)。5.6采用IFA方法（見GB/T14926.52）進(jìn)行檢測(cè)，或使用驗(yàn)證合格的等效試劑盒檢測(cè)。5.7采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法（見附錄A）進(jìn)行核酸檢測(cè)，或使用驗(yàn)證合格的等效試劑盒檢測(cè)。6結(jié)果判定6.1采用ELISA方法參照GB/T14926.50進(jìn)行結(jié)果判定，或按使用的等效試劑盒進(jìn)行判定。6.2采用IEA方法可參照GB/T14926.51進(jìn)行結(jié)果判定，或按使用的等效試劑盒進(jìn)行判定。6.3采用IFA方法可參照GB/T14926.52進(jìn)行結(jié)果判定，或按使用的等效試劑盒進(jìn)行判定。6.4采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法可參照附錄A進(jìn)行結(jié)果判定，或按使用的等效試劑盒進(jìn)行判定。對(duì)于血清學(xué)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，選用同一種方法或另一種方法重試，如仍為陽(yáng)性則判為陽(yáng)性。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR方法陽(yáng)性或可疑結(jié)果，用同一種方法重試，如仍為陽(yáng)性或可疑，則判為陽(yáng)性。7結(jié)果報(bào)告根據(jù)判定結(jié)果，出具報(bào)告。（規(guī)范性附錄）小鼠細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法A.1核酸檢測(cè)樣本的采集和處理采樣過(guò)程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過(guò)程中須戴一次性手套。A.1.1臟器組織活體小鼠安樂死后剖檢，無(wú)菌采集腸系膜淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肝臟或腫瘤組織，剪取2-3mm3的待檢樣本于2mL無(wú)菌離心管，加入200μL裂解液，使用電動(dòng)勻漿器或其他勻漿儀器將組織充分破碎勻漿約2min，然后將組織懸液3000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌2mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.2盲腸內(nèi)容物或糞便無(wú)菌采集小鼠盲腸內(nèi)容物或糞便于2mL無(wú)菌離心管中，加入適量體積的PBS（1-2粒糞便約加入0.4mLPBS）。使用電動(dòng)勻漿器或其他勻漿儀器充分破碎勻漿約2min，12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.3實(shí)驗(yàn)接種物（如腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織）吸取新鮮或凍融過(guò)的細(xì)胞懸液200μL，加入1.5～2倍體積的裂解液混勻，編號(hào)備用。其他生物制品與細(xì)胞處理相同。腫瘤組織采集和處理參考A.1.1臟器組織。A.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本取適量小鼠飼料和墊料至50mL無(wú)菌離心管中，加入足夠體積的滅菌PBS，浸泡成勻漿，充分渦旋混勻，1750r/min離心3min，將1.5mL的上清液轉(zhuǎn)移至2.0mL無(wú)菌離心管中，12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌2mL離心管中，編號(hào)備用。取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。用粘性無(wú)菌拭子或無(wú)菌棉拭子擦拭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物、房間中或其他設(shè)備重點(diǎn)區(qū)域表面，將拭子從根部折斷，保留拭子棉頭，置于2mL無(wú)菌離心管中，加入能沒過(guò)拭子的最少體積裂解液浸泡，充分渦旋混勻，12000r/min離心1min，吸取浸泡液至另一2mL無(wú)菌離心管，編號(hào)備用。A.2樣本的運(yùn)輸和存放采集或處理的樣本在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。A.3樣本DNA的提取參照核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣本DNA的提取。提取后的DNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行下一步，應(yīng)于-20℃保存?zhèn)溆?。A.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)A.4.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、和陰性對(duì)照。反應(yīng)參數(shù)見表3。13317否15是A.4.2實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判定A.4.2.1結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果，包括擴(kuò)增曲線和Ct值（Ct值cyclethreshold，即實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。A.4.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)特異性擴(kuò)增曲線。陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)特異性擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)≤37，并且有明顯的特異性擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR