實(shí)驗(yàn)動物 仙臺病毒檢測方法 征求意見稿

2實(shí)驗(yàn)動物仙臺病毒檢測方法本文件規(guī)定了仙臺病毒（Sendaivirus,SV）的檢測方法。本文件適用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動物的仙臺病毒的檢測，或?qū)嶒?yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境樣本和動物源性生物制品中仙臺病毒的檢測。2.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.42實(shí)驗(yàn)動物細(xì)菌學(xué)檢測標(biāo)本采集GB/T14926.50實(shí)驗(yàn)動物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)GB/T14926.51實(shí)驗(yàn)動物免疫酶試驗(yàn)GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動物免疫熒光試驗(yàn)GB/T14926.54實(shí)驗(yàn)動物血凝抑制試驗(yàn)GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T5110-2019仙臺病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范3.原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）/免疫酶試驗(yàn)（IEA根據(jù)免疫學(xué)原理，采用SV抗原檢測小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔血清中仙臺病毒抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的酶標(biāo)二抗結(jié)合，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。顏色反應(yīng)的深淺與待檢血清中所含有的SV抗體的量成正比。免疫熒光試驗(yàn)（IFA采用SV抗原檢測小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔血清中仙臺病毒抗體，兩者形成的抗原抗體復(fù)合物可與相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合，在紫外光或藍(lán)紫光的照射下，激發(fā)出可見的熒光，在熒光顯微鏡下以熒光的有無和強(qiáng)弱判定結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)（HAI在一定條件下，SV凝集雞、豚鼠紅細(xì)胞的能力可被特異性抗體所抑制。根據(jù)這一特性檢測小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔血清中有無SV抗體。核酸檢測：根據(jù)仙臺病毒保守序列基因，設(shè)計合成一對RT-PCR（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）引物（和特異性探針）。提取樣本中的病毒RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別通過特異引物（和探針）在DNA3聚合酶作用下，經(jīng)過變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)，進(jìn)行特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，根據(jù)檢測結(jié)果判定樣品中是否含有仙臺病毒核酸。4.主要試劑和器材4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原用SV感染9d齡SPF雞胚尿囊腔，培養(yǎng)于36℃溫箱，72h后收凍于4℃,次日無菌收取尿囊液，4℃2000r/min離心10min，用0.5%雞或豚鼠紅細(xì)胞和SV陽性血清做血凝和血凝抑制試驗(yàn)，驗(yàn)證其病毒特異性和血凝效價。上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.1.2正?？乖?d齡SPF雞胚尿囊液。4.1.2抗原片SV感染BHK21細(xì)胞，接種后2~3d，病變達(dá)++~+++時用胰酶消化分散，PBS洗滌，涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。4.1.3血凝素見ELISA特異性抗原的制備。4.1.4陽性血清SV抗原免疫SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通級兔所獲得的抗血清。4.1.5陰性血清SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清和無仙臺病毒感染的兔血清。4.1.6酶結(jié)合物辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測相應(yīng)動物血清抗體；上述酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，用于檢測兔血清抗體；上述酶標(biāo)記葡萄球菌蛋白A（SPA）可用于小鼠、豚鼠、地鼠、兔血清抗體的檢查。4.1.7熒光標(biāo)記物異硫氰酸熒光素、Dylight488等熒光標(biāo)記物標(biāo)記羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗體，用于檢測相應(yīng)動物血清抗體；用上述標(biāo)記物標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，用于檢測兔血清抗體。4.1.8引物和探針4.1.8.1RT-PCR擴(kuò)增引物（參考SN/T5110-2019）4表1仙臺病毒RT-PCR引物序列4.1.8.2實(shí)時熒光RT-PCR擴(kuò)增引物和探針表2仙臺病毒實(shí)時熒光RT-PCR引物序列4.2器材4.2.1酶標(biāo)儀。4.2.2熒光顯微鏡。4.2.3普通顯微鏡。4.2.437℃培養(yǎng)箱或水浴箱。4.2.5實(shí)時熒光PCR儀。4.2.6PCR儀。4.2.7電泳儀4.2.8凝膠成像分析系統(tǒng)5.檢測方法5.1生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。5.2實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求實(shí)驗(yàn)室總體技術(shù)要求和檢驗(yàn)質(zhì)量控制的基本要求參考GB/T19495.2的規(guī)定5.3樣本采集及處理5.3.1血清的采集參見GB/T14926.424.3血清采樣。5.3.2臟器組織、盲腸內(nèi)容物或糞便、實(shí)驗(yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境樣本等的采集參見附錄A55.4采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進(jìn)行血清學(xué)檢測，或按照等效商業(yè)化ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。5.5采用IFA方法（見GB/T14926.52）進(jìn)行血清學(xué)檢測，或按照等效商業(yè)化IFA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。5.6采用IEA方法（見GB/T14926.51）進(jìn)行血清學(xué)檢測，或按照等效商業(yè)化IEA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。5.7采用HAI方法（見GB/T14926.54）進(jìn)行血清學(xué)檢測，或按照等效商業(yè)化HAI試劑盒說明書進(jìn)行檢測。5.8采用PCR方法（見附錄A）進(jìn)行核酸檢測，或按照等效商業(yè)化PCR試劑盒說明書進(jìn)行檢測。6.結(jié)果判定6.1ELISA/IFA/IEA對陽性檢測結(jié)果，選用同一種方法或另一種方法重試。如仍為陽性則判為陽性。6.2HAIHAI抗體效價小于等于1:10判為陰性，大于1：10判為陽性；對陽性樣本，選用同一種方法重試，如為陽性則判為陽性。6.3RT-PCR結(jié)果判定對陽性結(jié)果，用同一種方法或?qū)崟r熒光RT-PCR重試。如仍為陽性，則判為陽性。6.4實(shí)時熒光RT-PCR結(jié)果判定對陽性或可疑結(jié)果，用同一種方法重試。如仍為陽性或可疑，則判為陽性。7.結(jié)果報告根據(jù)判定結(jié)果，出具報告。6（規(guī)范性附錄）仙臺病毒PCR檢測方法A.1主要設(shè)備和材料A.1.1實(shí)時熒光PCR儀A.1.2PCR儀。A.1.4凝膠成像分析系統(tǒng)。A.1.5Nanodrop紫外分光光度計。A.1.6高速冷凍離心機(jī)A.1.7臺式離心機(jī)。A.1.8恒溫孵育器。A.1.9漩渦振蕩器。A.1.10組織勻漿器或手持式均質(zhì)器。A.1.11生物安全柜。A.1.12PCR工作臺。A.1.13-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.14微量移液器（10μL，100μL，1000μL）A.1.15無RNase和DNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL無RNase和DNase的吸頭（10μL，200μL，1mL無RNase和DNase的PCR擴(kuò)增反應(yīng)管。A.2試劑除特別說明外，以下實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O771.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL去離子水溶解稀釋，用HCl調(diào)pH至7.2，最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2無DNase/RNase去離子水實(shí)驗(yàn)用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.3RNA抽提試劑TRIzol或其他等效產(chǎn)品。A.2.4無水乙醇。A.2.575%乙醇（無DNase/RNase去離子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7異丙醇。A.2.8逆轉(zhuǎn)錄試劑A.2.9PCR試劑：rTaq酶、10×PCRBuffer、dNTP。A.2.10DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。A.2.11TAE電泳緩沖液A.2.11.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·H2O）滅菌去離子水5mol/L氫氧化鈉溶液滅菌去離子加至100mL，121℃,15min滅菌備用。A.2.11.250×TAE電泳緩沖液配制羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0滅菌去離子加至1000mL，121℃,15min滅菌備用。用時用滅菌去離子水稀釋至l×使用。A.2.12溴化乙錠：10mg/mL溴化乙錠滅菌去離子水18.61g80mL調(diào)pH至8.0242gl00mL200mg20mL8A.2.131.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1.5g1×TAE電泳緩沖液加至l00mL混合后加熱至完全融化,待冷至50℃~55℃時，加溴化乙錠(EB)或其他等效核酸染料，輕輕晃動搖勻后將瓊脂糖溶液倒入電泳板制成凝膠。A.2.14一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR試劑盒或等效試劑盒。A.2.15引物和探針：根據(jù)表1和表2的序列合成引物和探針，引物和探針加無RNase去離子水分別配制成20μmol/L儲備液，-20℃保存。A3樣本的采集A3.1臟器組織將活體動物安樂死后剖檢，無菌采集動物的肺、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、或脾臟，剪取待檢樣品2.0g于無菌離心管。A3.2盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣品2.0g于無菌離心管中。A3.3實(shí)驗(yàn)接種物直接取待測細(xì)胞培養(yǎng)物、腫瘤組織等待測實(shí)驗(yàn)接種物于無菌離心管中。A3.4實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境樣本取適量實(shí)驗(yàn)動物飼料和墊料置于無菌樣品袋中；取適量實(shí)驗(yàn)動物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；用無菌拭子拭取實(shí)驗(yàn)動物籠具出風(fēng)口初效濾膜表面粉塵裝入無菌離心管中；取籠具系統(tǒng)內(nèi)置的出風(fēng)口粉塵吸附介質(zhì)裝入無菌離心管中；用無菌拭子拭取實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境中的待測位置后裝入無菌離心管中。A3.5樣本的運(yùn)輸和存放樣本采集后應(yīng)密封、加冰并盡快運(yùn)送到檢測實(shí)驗(yàn)室。在2~8℃條件下暫存應(yīng)不超過24h，若不能立即檢測應(yīng)-20℃保存，若需長期保存，須置于-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。A.4樣本RNA提取使用TRIzol或其他等效產(chǎn)品提取RNA，TRIzol對人體有害，使用時應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。A.4.1取200μL處理后的樣本加1mLTRIzol后，充分混勻，室溫靜置10min使其充分裂9解。A.4.2按每毫升TRIzol加入200μL氯仿，蓋緊樣本管蓋，用手用力振蕩搖晃離心管15s；A.4.3離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA存在于水樣層當(dāng)中，水樣層的容量大約為所加TRIzol容量的60%。吸取上層水相至另一離心管中，注意不要吸取中間界面。A.4.4按每毫升TRIzol加入0.5mL異丙醇異丙醇混勻，室溫放置10min。4℃12000r/min離心10min，棄上清，RNA沉淀一般形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。A.4.5按每毫升TRIzol加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃7500r/min離心5min，棄上清，將離心管倒立吸水紙上，盡量使液體流干。A.4.6室溫自然風(fēng)干干燥5~10min，RNA樣本不要過于干燥。A.4.7用50~100μL無RNase去離子水溶解RNA樣品，制備好的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)；若暫時不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩.5RT-PCR檢測A.5.1RNA逆轉(zhuǎn)錄RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表3。反應(yīng)液的配制在冰浴上操作，反應(yīng)條件為37℃、15min；表3RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系28A.5.2PCR反應(yīng)普通PCR反應(yīng)體系見表4。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。表4PCR反應(yīng)體系25A.5.3PCR反應(yīng)參數(shù)PCR反應(yīng)參數(shù)見表5表5普通PCR反應(yīng)參數(shù)11A.5.4RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄電泳結(jié)果。A.5.5RT-PCR結(jié)果判定陰性對照和空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大?。?90bp）的目的擴(kuò)增條帶，則滿足質(zhì)控要求；否則此次試驗(yàn)無效，需重新測試。A.5.5.1質(zhì)控成立條件下，樣本未出現(xiàn)預(yù)期大小（490bp）的擴(kuò)增條帶，則可判定為陰性。A.5.5.2質(zhì)控成立條件下，樣本出現(xiàn)預(yù)期大?。?90bp）的擴(kuò)增條帶，則可判定為陽性。A.5.5.3序列測定必要時，可取待檢樣本擴(kuò)增出的陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測定，序列結(jié)果與已公開發(fā)表的仙臺病毒特異性片段序列進(jìn)行比對，序列同源性在95%以上，可判定為陽性，否則判定為陰性。A.6實(shí)時熒光RT-PCRA.6.1實(shí)時