實驗動物 小鼠腦脊髓炎病毒檢測方法 征求意見稿

2GB/T14926.26—202X實驗動物小鼠腦脊髓炎病毒檢測方法本文件規(guī)定了小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）的檢測方法。本文件適用于實驗小鼠及其相關(guān)產(chǎn)品、實驗動物環(huán)境樣本、動物源性生物制品中TMEV的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.50實驗動物酶聯(lián)免疫吸附試驗GB/T14926.51實驗動物免疫酶試驗GB/T14926.52實驗動物免疫熒光試驗GB/T14926.54實驗動物血凝抑制試驗GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求3原理3.1抗體檢測原理根據(jù)免疫學(xué)原理，采用TMEV抗原檢測小鼠血清中TMEV抗體；或根據(jù)TMEV在一定的條件下，能凝集人“O”型紅細胞，這種凝集紅細胞的能力可被特異性抗體所抑制的原理，檢測小鼠血清中的TMEV抗體。3.2核酸檢測原理根據(jù)小鼠腦脊髓炎病毒非編碼蛋白（UTR）基因序列，設(shè)計合成一對特異性引物和一條特異性探針，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，淬滅作用消失，熒光信號產(chǎn)生并被檢測儀器接受，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈對應(yīng)關(guān)系。從而通過識別熒光信號對樣本中的TMEV核酸進行檢測。4主要試劑和器材4.1試劑：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原3GB/T14926.26—202XTMEV（GDⅦ株）感染小鼠，待發(fā)病后無菌取腦，研磨，制成10%懸液，3000rpm離心10分鐘后取上清液接種BHK21細胞，吸附1.5~2小時，加維持液培養(yǎng)4~5天左右，當(dāng)細胞病變達++～+++時收獲。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.1.2正?？乖瑽HK21細胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片TMEV（GDⅦ株）感染BHK21細胞，培養(yǎng)4~5天，病變達++～+++時，將細胞用胰酶分散，用PBS洗滌，滴片。室溫干燥后，冷丙酮固定10分鐘，-20℃保存。4.1.3血凝素腦腔接種（0.02ml/只）14～21日齡小鼠5～7天后，無菌取腦，研磨，制成10%懸液，凍融2~3次，1000rpm離心10分鐘，上清中加入等量的0.5%胰酶,，4℃可短期保存。4.1.4陽性血清TMEV病毒抗原免疫SPF小鼠所獲得的抗血清。4.1.5陰性血清SPF小鼠血清。4.1.6酶結(jié)合物辣根過氧化物酶標記羊或兔抗小鼠IgG抗體；或辣根過氧化物酶標記葡萄球菌蛋白A（SPA）。4.1.7異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠IgG抗體。4.1.8核酸檢測試劑4.1.8.1經(jīng)DEPC處理的無RNA酶水或商品無RNA酶水。4.1.8.2市售RNA抽提試劑盒4.1.8.3實時熒光RT-PCR基礎(chǔ)反應(yīng)液：市售商品化試劑4.1.8.4陽性對照：為含有TMEV病毒核酸的組織樣本或細胞培養(yǎng)物。4.1.8.5陰性對照為不含TMEV病毒核酸的組織樣本或細胞培養(yǎng)物。4.1.8.6根據(jù)表1的序列合成引物和探針，引物和探針配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。表1實時熒光RT-PCR擴增引物和探針4GB/T14926.26—202X4.2器材4.2.1酶標儀4.2.2熒光顯微鏡4.2.3普通顯微鏡4.2.437℃培養(yǎng)箱或水浴箱4.2.5實時熒光PCR儀、PCR儀4.2.6高速冷凍離心機。4.2.7普通離心機。4.2.8組織勻漿器4.2.9生物安全柜。4.2.10PCR超凈工作臺。4.2.11微量移液器（0.1~2μL，1~10μL，10~100μL，100~1000μL）。4.2.12無RNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），無RNase的吸頭（10μL，200μL，1mL），無RNase的PCR擴增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。4.2.13采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。5檢測方法5.1生物安全措施實驗操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進行相應(yīng)操作。5.2采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進行血清學(xué)檢測，或使用經(jīng)驗證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。5.3采用IFA方法（見GB/T14926.52）進行血清學(xué)檢測，或使用經(jīng)驗證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。5.4采用IEA方法（見GB/T14926.51）進行血清學(xué)檢測，或使用經(jīng)驗證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。5.5采用HAI方法（見GB/T14926.54）進行血清學(xué)檢測，或使用經(jīng)驗證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。5GB/T14926.26—202X5.6采用實時熒光PCR方法（見附錄A）進行TMEV核酸檢測，或使用經(jīng)驗證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。6結(jié)果判定6.6.1抗體檢測結(jié)果判定對陽性或可疑結(jié)果，選用同一種抗體檢測方法或另一種抗體檢測方法復(fù)測。如仍為陽性則判為陽性。6.26.2核酸檢測結(jié)果判定對陽性或可疑結(jié)果，用同一種核酸檢測方法復(fù)測，或取可疑陽性樣本PCR產(chǎn)物進行核酸序列測定，如仍為陽性，則判為陽性。7結(jié)果報告根據(jù)判定結(jié)果，作出報告。6GB/T14926.26—202X（規(guī)范性附錄）小鼠腦脊髓炎病毒核酸檢測方法A.1采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套A.1.1臟器組織活體動物采用安樂死方法進行處死，剖檢，無菌采集動物的腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腸，待檢樣品按照5倍比例加入滅菌PBS，組織勻漿器充分勻漿3~5分鐘，離心取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號備用。A.1.2盲腸內(nèi)容物或糞便無菌采集動物盲腸內(nèi)容物或糞便，按照5倍比例加入滅菌PBS，充分勻漿，離心取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，編號備用。A.1.3細胞培養(yǎng)物將接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，細胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無菌15mL離心管中，編號備用。A.1.4實驗動物環(huán)境樣本A.1.4.1實驗動物飼料、墊料和飲水取適量實驗動物飼料和墊料置于聚乙烯薄膜袋中，加入10倍體積滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4℃,12,000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。取適量實驗動物飲水直接轉(zhuǎn)移到無菌5mL離心管中，編號備用。A.1.4.2實驗動物設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實驗動物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,12,000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.1.5樣本的存放采集或處理的樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h，若需長期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。7GB/T14926.26—202XA.2病毒核酸提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒。按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照樣品，按同樣方法提取RNA。RNA的提取操作應(yīng)在生物安全柜中進行，避免RNA氣溶膠的污染。制備好的RNA應(yīng)盡快進行下一步PCR反應(yīng)，若暫時不能進行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.3實時熒光RT-PCRA.3.1反應(yīng)體系一步法實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時設(shè)計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有TMEV的組織或細胞培養(yǎng)物提取的RNA作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有TMEVRNA樣本（可以是正常動物組織或正常細胞培養(yǎng)物）作為陰性對照模板，空白對照即為不加模版對照（NoTemplateControl，NTC即在反應(yīng)中用水來代替模板。表2每個樣本反應(yīng)體系配制表111118A.3.2反應(yīng)參數(shù)實時熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見表3：表3：實時熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)否18GB/T14926.26—202X1是試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。A.4實時熒光PCR結(jié)果判定A.4.1結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品樣本擴增曲線的最高點為準。A.4.2質(zhì)控標準A.4.2.1空白對照無Ct值，并且無熒光擴增曲線。A.4.2.2陰性對照無Ct值，并且無熒光擴增曲線。A.4.2.3陽性對照Ct值應(yīng)≤35，并且有明顯的熒光擴增曲線，則表明反應(yīng)體系運行正常，否則此次試驗無效，需重新進行實時熒光PCR擴增。A.4.3結(jié)果判定A.4.3.1若待檢樣品無熒光擴增曲線，則判定樣品TMEV病毒核酸陰性。A.4.3.2若待檢樣品有熒光擴增曲線，且Ct值≤35時，則判斷樣品TMEV病毒核酸陽性。A.4.3.3若待檢樣品Ct值介于35和40之間時，應(yīng)重新進行實時熒光PCR檢測。重新檢測后，若Ct值≥40時，則判