2025食品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定

DeterminationofBacilluscereuscereulidein 前 規(guī)范性引用文 術(shù)語和定 原 試 儀器設(shè)備與耗 分析步 測 結(jié)果計(jì) 精密 其 本文件適用于面米制品、乳及乳制品中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定，也適用于食物中毒嘔吐物中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的測定。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素經(jīng)乙腈提取，采用固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682乙腈（CH3CN）甲醇（CH3OH）氯化鈉（NaCl）甲酸（HCOOH）乙酸銨（CH3COONH4）：01%1.0mL1000mL01%甲酸-2.0mmol/L0156g1.0mL甲酸，用水溶解稀釋定容至1000mL01%1.0mL1000mL蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（C57H96N6O18，CAS號(hào)：157232-64-9），濃度為25μg/500μL或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)品。蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0mg/L）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.31）0.200mL10.0mL棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至10.0mL，濃度為1.0mg/L18℃冷凍保存，有效期3個(gè)月。蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0mg/L）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.3.2）0.500，置于10.0mL10.0mL1.0mg/L183蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1mg/L）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.4.1）1.0mg/L）置于10.0mL01mg/L18保存，有效期1.mL，置于10.0mL棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀釋成01mg/L18℃冷凍保存，有效期1個(gè)月。01mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.3），10μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1000μL10.0mL200μL01mg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.4）（AB8:2）01μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，含內(nèi)標(biāo)濃度為2.0μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。超高效液相色譜-0.001g高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min新型反相固相萃取柱（HLB-P）：200mg，6mL高效除脂硅鋯骨架復(fù)合多孔材料固相萃取柱（HMR）：500mg，6mL有機(jī)相濾膜：0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)對(duì)目標(biāo)物無吸附）250g的面米制品，采用多點(diǎn)取樣法，取250g樣品，按照1:3比例加水均質(zhì)，18250g的面米制品，則取全部樣品，按照1:318℃以下冷凍保存，取樣前恢復(fù)至室溫。1818mg/L）20μL，靜置30min后，準(zhǔn)確加入5.0mL乙腈，渦旋混均30s，超聲30min。4℃下000r/min離心10min15mL離心管中，加入5.0mL水，渦旋混合30s，待HLB-PHLB-P柱經(jīng)3.0mL甲醇，3.0mL純水依次活化，取食品樣品提取液（7.2.1）上樣（如果上柱溶液粘度較大，過濾較為緩慢，可以1.2mL/min速度抽濾過柱），待上樣液完全過柱后，以3.0mL純水淋洗小柱，5.0mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，氮?dú)鉂饪s至近干，殘?jiān)?.0mL初始流動(dòng)相（流動(dòng)相A與B體積比為8:2）復(fù)溶，過微孔濾膜供上機(jī)測定。吸取食物中毒嘔吐物樣品提取液（7.2.2）5.0mL，直接上HMR小柱凈化，棄去前0.5mL過柱液后收集2.0mL過柱溶液，過膜供上機(jī)測定。色譜柱：WatersACQUITYUPLCPeptideBEHC18Column，300?色譜柱(21mm×100mm1.7μm）流動(dòng)相：流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸-2.0mmol/L流速：0.35柱溫：40進(jìn)樣量：5梯度洗脫程序見表1表1梯度洗脫程序時(shí)間（ESI+質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測毛細(xì)管電壓：3.5離子源溫度：150脫溶劑溫度：500脫溶劑氣流量：1000碰撞室壓力：0.36監(jiān)測參數(shù)見表2表2蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素監(jiān)測參數(shù)注：*將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應(yīng)的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，以各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素濃度(g/L）為橫坐標(biāo)，以蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素和13C6-蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將試樣溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應(yīng)的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素及其內(nèi)標(biāo)的峰面積。試液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少取樣量后重新測定。試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5％之內(nèi)。選擇的蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，且試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。表 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏相對(duì)離子豐度>50允許的最大偏差試樣中蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素含量公式（1）??=??

X——ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中待測真菌毒素的濃度，單位為納克每毫升V——樣品經(jīng)凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升m——試樣的取樣量，單位為克f——提取液稀釋因子，食品樣品f=3，食物中毒嘔吐物樣品f=0.以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留3在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的20%食品