CN202410249417.5 - 黃楊堿在制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用配方專利技術(shù)

A61K31/57(2006.01)A61P35/00(2006.01)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了黃楊堿能夠顯著抑制骨肉瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)還證明了黃楊堿可能通過作用于V-ATP22.用于治療骨肉瘤的藥物，其特征在于，所述3黃楊堿在制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及黃楊堿在制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)[0002]骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種罕失常、心肌缺血、冠心病、心力衰竭和缺血性中風(fēng)。CVB-D也是中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)于2009年批準(zhǔn)的治療心血管功能障礙一線藥物之一黃楊寧分散片的活性成分。此4[0010]本發(fā)明在體內(nèi)外證明了CVB-D具有抗OS的作用，可阻止腫瘤增殖、遷移和侵襲能[0014]圖4是實(shí)施例1中的流式細(xì)胞周期分析結(jié)果圖(其中，F(xiàn)為流式細(xì)胞周期分析結(jié)果[0024]圖14是實(shí)施例3中的免疫印跡結(jié)果圖(其中，F(xiàn)為蛋白條帶圖，G為蛋白條帶定量5[0034]圖24是實(shí)施例4中的免疫印跡結(jié)果圖(其中，F(xiàn)為蛋白條帶圖，G為蛋白條帶定量年骨肉瘤的五年生存率沒有明顯提升，而化療的不良反應(yīng)又嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，于V-ATP酶V0亞基α1(ATP6V0A1)，降低溶酶體的pH值和抑制組織蛋白酶的成熟引起自噬流[0045]黃楊堿(CVB-D)購自成都瑞芬思有限公司(中國)，并溶于甲醇中至儲存濃度為ATP6V0A1抗體購買自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。其他抗體均來源于CellSignaling[0048]將離體的人OS細(xì)胞系143B用10％胎牛血清(Wisent，Canada)的DMEM培養(yǎng)基6[0049]實(shí)施例1-5的檢測結(jié)果按照如下進(jìn)行統(tǒng)計分析：原始數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差[0056]克隆形成測定實(shí)驗(yàn)：將人OS細(xì)胞143B和HOS以500個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板和c-Myc的蛋白質(zhì)水平隨著CVB-D的濃7培養(yǎng)至細(xì)胞板密度達(dá)到約90100％。用無菌的10μL移液管尖端沿每個孔的直徑以恒定腔加入400μL含有2.5×104個骨肉瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。將24孔板放入37℃孵箱中培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，4％多聚甲醛固定這些小室底部的細(xì)胞30min，然后用結(jié)晶紫染色[0066]上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解在腫瘤遷移和侵襲過程中具有重1000稀釋)在4℃下孵育過夜。用TBST沖洗三次，將膜在37℃下用含有HRP偶聯(lián)的二抗(1:8達(dá)到約30％。用不同濃度的CVB?D處理細(xì)胞24小時，然后用0.25％胰蛋白酶消化成單個細(xì)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(2017版)獲得(http://lilab?/pharmmapper/)，通過在線Venny工具(b.csic.es/tools/venny/index.html)作CVB?D和OS共同靶點(diǎn)的Venny圖，并獲取共同靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)由STRING數(shù)據(jù)庫共同靶點(diǎn)之間的相互作用。在PPI網(wǎng)的內(nèi)圈中的20個靶點(diǎn)是通過cytohubba按照MCC值進(jìn)行靶點(diǎn)包括AKT1，暗示AKT1可能比Akt蛋白家族中的其他家族成員發(fā)揮更為重要的作用。因此，使用WesternBlot來證明PI3K?AKT1通路及其下游分子，如哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)9[0077]現(xiàn)有技術(shù)表明PI3K-AKT-mTOR通路不僅與細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡有關(guān)，而且可以促噬抑制劑A1(BafA1)作為堿化對照組，BafA1組顯示出較暗的綠色熒光，而在CVB-D處理組目標(biāo)蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)來自PDB數(shù)據(jù)庫(/).DiscoveryStudio軟件和獲取細(xì)胞總蛋白上清，用CVB-D(540μmol/L)或甲醇在室溫下處理2小時，并等分到0.2mL[0090]從圖22以看出，用CETSA展示了黃楊堿能夠增強(qiáng)ATP6V0A1的熱穩(wěn)定性，驗(yàn)證了胞活力高于單用CVB-D組。進(jìn)一步驗(yàn)證了CVB-D與BafA1的作用是相反的，BafA1可以恢復(fù)[0092]在本實(shí)施例中，建立了OS細(xì)胞的裸鼠腫瘤模型，進(jìn)一步探索CVB-D的體內(nèi)抗OS潛[0093]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：本研究所有動物相關(guān)實(shí)驗(yàn)均經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。胞懸浮液(2×107個細(xì)胞/mL)注射到小鼠的脛骨近端。當(dāng)腫瘤約為黃豆大小(直徑達(dá)到5mm