DB11-T 960-2013 梅花鹿胚胎移植技術規(guī)程

ICS65.020.30

B44

備案號:36785-2013DB11

北京市地方標準

DB11/T960—2013

梅花鹿胚胎移植技術規(guī)程

Codeofpracticeonembryotransferinthesikadeer

2013-01-31發(fā)布2013-05-01實施

北京市質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布

DB11/T960—2013

梅花鹿胚胎移植技術規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了供體鹿選擇、超數(shù)排卵及配種、手術法沖胚、胚胎質(zhì)量鑒定、受體鹿移植方法和記錄。

本標準適用于梅花鹿的胚胎生產(chǎn)和移植。

2術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

2.1

供體鹿donor

在胚胎移植過程中提供胚胎的母鹿個體。

2.2

受體鹿recipient

在胚胎移植過程中接受胚胎的母鹿個體。

2.3

試情公鹿teasterdeer

用于母鹿發(fā)情鑒定,輸精管結(jié)扎的公鹿。

2.4

超數(shù)排卵multipleovulation

在母畜發(fā)情周期的適當時間，應用外源促性腺激素處理，使卵巢比自然發(fā)情時有更多的卵泡發(fā)育并

排卵，也簡稱為“超排”。

2.5

陰道栓vaginalsuppository

一種內(nèi)含孕酮、用特制的放置器將其放入陰道的同期發(fā)情裝置。

2.6

胚胎移植embryotransfer

將體內(nèi)、外生產(chǎn)的哺乳動物早期胚胎，移植到另一頭同種的生理狀態(tài)相同或相似的雌性動物生殖道

內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體的技術。

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3供體鹿選擇、超數(shù)排卵及配種

3.1供體鹿選擇

體況良好、生殖機能正常，系譜完整、有種用價值且年齡在3～5周歲的成年母鹿。

3.2超數(shù)排卵

放置陰道栓（當天記為第0天）后第9天開始注射促卵泡素（FSH），每天注射兩次間隔12h，早晚各

1次，4天8次等量或減量注射。到第12～13天結(jié)束，共注射FSH320mg。第7次注射FSH時取出陰道栓。

3.3發(fā)情鑒定

陰道栓取出后24小時開始用試情公鹿每隔6h試情一次，每次持續(xù)0.5h～1h。母鹿穩(wěn)定接受爬跨即為

發(fā)情。

3.4配種

供體鹿發(fā)情后8h～12h麻醉，直腸把握人工授精配種。間隔8h～12h重復輸精一次。每次輸精凍精劑

量為2支/頭（每支凍精的有效精子數(shù)在1000萬以上）。

4手術法沖胚

4.1沖胚器材、藥品及試劑

4.1.1器材

套管針、沖胚管、注射器、腸鉗夾、培養(yǎng)皿、手術刀、手術縫合針和縫合線、體式顯微鏡、恒溫板

等。

4.1.2藥品及試劑

含0.3%胎牛血清的磷酸緩沖液（PBS）、胚胎保存液（Holding液）、青霉素、鏈霉素、石蠟油、麻

醉藥、解麻藥等。

4.2沖胚

4.2.1術前準備

供體母鹿第一次配種后6d～7d手術法沖胚，母鹿術前禁食24h。

4.2.2麻醉與保定

術前進行全身麻醉。沖胚時將母鹿放于保定架，呈前低后高仰臥保定。

4.2.3術部消毒

術部位于腹部中線距乳房約4cm處。麻醉后的母鹿術部備皮，用溫水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。

4.2.4手術方法

4.2.4.1沖胚在沖胚室內(nèi)進行。

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4.2.4.2在腹部中線距乳房基部前約4cm處做一切口，然后將兩側(cè)子宮角和輸卵管暴露，觀察左右卵

巢上的黃體發(fā)育情況并記錄。

4.2.4.3在一側(cè)子宮角基部用止血鉗穿孔，插入沖胚管，由充氣管注入5ml左右空氣,使氣囊封阻子宮

腔；在子宮角和輸卵管結(jié)合部的子宮角端插入套管針，拔出針芯，將裝有PBS的50ml注射器接到套管

針上，然后注入35℃～37℃的PBS30ml～50ml，將胚胎從子宮角的上端沖出，由沖卵管的出液孔收集

于培養(yǎng)皿（直徑90mm）中,放氣后取下沖胚管。

4.2.4.4用同樣方法沖取另一側(cè)子宮角的胚胎。

4.2.4.5沖胚完成后將子宮角放回體內(nèi)，并用0.9%的生理鹽水進行沖洗,并注入2ml石蠟油以防止生

殖道粘連。

4.2.5縫合與消毒

左右子宮角創(chuàng)口各縫1針,腹膜和肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)結(jié)縫合，用5%碘酊消毒。術后3天內(nèi)每天

注射2次青霉素、鏈霉素等抗生素。

5胚胎質(zhì)量鑒定

5.1檢胚

將沖胚后回收液平皿放在30℃的恒溫板上，在20℃～25℃的無菌操作室內(nèi)的體式顯微鏡下進行檢

查。檢出的胚胎用吸卵器移入PBS中進行鑒定，確定受精與否及胚胎發(fā)育階段。

5.2胚胎質(zhì)量分級

5.2.1配種后6d～7d的胚胎發(fā)育階段應為桑椹胚或囊胚。

5.2.2胚胎質(zhì)量分為A、B、C、D四個等級,A、B、C級胚胎為可用胚胎，D級為不可用胚胎。

——A級：胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，呈球形，分裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)

緊湊，色調(diào)和透明度適中，無游離的細胞和液泡,或很少，變性細胞比例少于10%；

——B級：胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致。輪廓清晰，分裂球大小基本一致，色調(diào)和透明度及細胞

密度良好，可見到一些游離的細胞和液泡，變性細胞占11%～30%；

——C級：胚胎發(fā)育和胚齡不太一致，輪廓不清晰，色調(diào)變暗，結(jié)構(gòu)較松散，游離的細胞或液泡較

多，變性細胞達31%～50%；

——D級：有碎片的卵、細胞無組織結(jié)構(gòu)，變性細胞占胚胎大部分，約75%。

6受體鹿移植

6.1移植器械、藥品及試劑

6.1.1器械

手術刀、手術縫合針和縫合線、腹腔內(nèi)窺鏡、宮頸鉗、移植針等。

6.1.2藥品及試劑

孕馬血清促性腺激素(PMSG)、胚胎保存液（Holding液）、5%碘酊、青霉素和鏈霉素等。

6.2受體鹿選擇

體況良好、生殖機能正常，年齡在2～5周歲的母鹿。

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6.3同期發(fā)情

受體鹿放置陰道栓進行同期發(fā)情，第12天撤栓（放栓當天記為第0天）。撤栓時肌肉注射300IU的PMSG。

6.4術前準備、麻醉、保定和消毒

同4.2.1、4.2.2和4.2.3的處理方法。

6.5胚胎移植

6.5.1移植方法

可采用腹腔內(nèi)窺鏡方法。

6.5.2受體鹿黃體的觀察

在乳房前方腹中線兩側(cè)各切開一個0.5cm～1cm長的小口，一側(cè)插入打孔器和腹腔鏡，另一側(cè)插入宮

頸鉗。通過腹腔鏡和宮頸鉗相互配合觀察受體鹿的卵巢狀態(tài)，記錄黃體數(shù)目。挑選單側(cè)卵巢1～3個黃體

的受體鹿進行胚胎移植。

6.5.3移植與縫合

6.5.3.1將卵巢上有1～3個黃體側(cè)的子宮角取出，在子宮角的上1/3部位穿刺，連接上結(jié)合有1ml

注射器的塑料移植針。

6.5.3.2將含有1～2枚胚胎的0.3ml～0.5m的Holding液，通過1ml注射器緩慢注入子宮角。

6.5.3.3受體鹿左右創(chuàng)口各縫1針，外涂5%碘酊。

6.5.3.4移植后肌肉注射黃體酮。

7記錄

胚胎移植過程中應記錄供體鹿超數(shù)排卵、輸精、沖胚、受體鹿移植情況,記錄內(nèi)容可參考附錄A。

4

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AA

附錄A

（資料性附錄）

梅花鹿胚胎移植記錄表

表A.1供體鹿超數(shù)排卵記錄表

養(yǎng)殖場：供體號：品種：

出生時間（年齡）：斷奶時間：胎次：

發(fā)情狀況：

超排處理時間：

激素：批號：總劑量：

第一天劑量：第二天劑量：第三天劑量：

第四天劑量：第五天劑量：第六天劑量：

第七天劑量：第八天劑量：

陰道栓：批號：總劑量：

放栓時間：撤栓時間：

促排藥：注射日期：劑量：

發(fā)情時間：發(fā)情表現(xiàn)：

輸精時間：公鹿號：精液品質(zhì)：

沖胚時間：

沖胚人：檢胚人：胚胎數(shù)量：

表A.2供體鹿沖胚記錄

供體號：沖胚時間：

卵巢未受

回收退化2～16細胚胎發(fā)育及等級

卵巢PBS回精卵

黃體數(shù)卵泡數(shù)卵數(shù)卵數(shù)胞

收率數(shù)

（CL）（F）枚數(shù)等級桑椹胚囊胚

A

B

左

C

D

A

B

左

C

D

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DB11/T960—2013

表A.3供體鹿沖胚匯總表

供體號經(jīng)產(chǎn)/育成沖胚時間黃體數(shù)胚胎數(shù)胚胎等級可用胚胎數(shù)備注