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PCR原理及檢測(cè)方法第1頁(yè),共53頁(yè)。

一、PCR的定義:

PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),又稱(chēng)體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。第2頁(yè),共53頁(yè)。

PCR技術(shù):1985年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng),可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上。優(yōu)點(diǎn):敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等,廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域,并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室,大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù),從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第3頁(yè),共53頁(yè)。

二、PCR的原理:

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段,類(lèi)似于天然DNA的復(fù)制過(guò)程。

以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板,以一對(duì)分別與模板5′末端和3′末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成,重復(fù)這一過(guò)程,即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。第4頁(yè),共53頁(yè)。

擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合,基本反應(yīng)步驟分三步:1.變性(Denaturation):加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復(fù)性)(Annealling):突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合,也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合,但由于引物的高濃度,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn),主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″第5頁(yè),共53頁(yè)。

3.延伸(Extension):將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度,在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下,以引物的3′端開(kāi)始,結(jié)合單核苷酸,形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。72℃1′

上述3步為一個(gè)循環(huán),每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò)25~40個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106~109倍。第6頁(yè),共53頁(yè)。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第7頁(yè),共53頁(yè)。第8頁(yè),共53頁(yè)。第9頁(yè),共53頁(yè)。

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期,原來(lái)的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用,隨著循環(huán)次數(shù)的遞增,由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板,最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。第10頁(yè),共53頁(yè)。

三、PCR的成分和作用:

1.緩沖液:

10

~50mMTris-Cl(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性25~50mMKCl促進(jìn)引物退火,>50mM會(huì)抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)對(duì)酶有一定的保護(hù)性,如質(zhì)量不好將起相反的作用,建議使用乙?;腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類(lèi)似作用。第11頁(yè),共53頁(yè)。2.MgCl2:

1.5~2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴(lài)性,顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量,過(guò)量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率,過(guò)低則酶活性顯著下降。第12頁(yè),共53頁(yè)。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.02~0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合,應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系,Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2~2.5mM。過(guò)高:加快反應(yīng)速度,還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過(guò)低:反應(yīng)速度下降,可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。第13頁(yè),共53頁(yè)。4.引物(Primer-P):預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列,決定特異性。

0.2~1μM

偏高:非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配,增加引物之間形成引物二聚體,產(chǎn)量降低。偏低:產(chǎn)量降低。第14頁(yè),共53頁(yè)。5.TaqDNA聚合酶:耐高熱0.5~5U/100μl

1U/25~50μl

偏高:引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低:產(chǎn)物量降低第15頁(yè),共53頁(yè)。6.模板DNA(Template):最低102~105bpDNA片段,實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)此量,用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1~5μl

過(guò)高:非特異產(chǎn)物增加過(guò)低:產(chǎn)量降低7.水:

去離子水,補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。第16頁(yè),共53頁(yè)。

四、PCR反應(yīng)體系:

各種成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行核算。第17頁(yè),共53頁(yè)。

五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、溫度、循環(huán)參數(shù):

⑴變性溫度和時(shí)間:

保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95℃,30~60s,再?gòu)?fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度,可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94℃30″,可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第18頁(yè),共53頁(yè)。

⑵復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇,可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和G+C含量確定,長(zhǎng)度在15~25bp之間時(shí),復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到,一般位于40~60℃,30~60s。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第19頁(yè),共53頁(yè)。

⑶延伸溫度和時(shí)間:一般位于Taq酶最適作用溫度70~75℃之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75℃。延伸反應(yīng)時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,<1Kb,1分鐘足夠;>1Kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間,10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá)15分鐘。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,常用72℃1′。

第20頁(yè),共53頁(yè)。

⑷循環(huán)數(shù):其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20~25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。第21頁(yè),共53頁(yè)。六、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析常用瓊脂糖凝膠電泳上排:1:marker2:陰性對(duì)照3-17:標(biāo)本(引物為CA16)下排:1-3:標(biāo)本(引物為CA16)4:CA16引物的陽(yáng)性對(duì)照5:marker6:陰性對(duì)照7-14:標(biāo)本(引物為EV71)15:EV71引物的陽(yáng)性對(duì)照第22頁(yè),共53頁(yè)。RT-PCR技術(shù)RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。第23頁(yè),共53頁(yè)。Real-TimePCR技術(shù)

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。第24頁(yè),共53頁(yè)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端,而淬滅劑則在3’末端。第25頁(yè),共53頁(yè)。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,因而熒光基團(tuán)發(fā)射出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。第26頁(yè),共53頁(yè)。

一般而言,熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系,所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。第27頁(yè),共53頁(yè)。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值(thresholdvalue)。第28頁(yè),共53頁(yè)。第29頁(yè),共53頁(yè)。第30頁(yè),共53頁(yè)。PCR檢測(cè)對(duì)標(biāo)本采集及保存、

運(yùn)輸?shù)囊笱适米?、糞便、皰疹液、腦脊液等。用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本盡早采集。病毒儲(chǔ)存液保存。冷鏈運(yùn)輸,盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。-20℃長(zhǎng)期保存,但是流感樣病例標(biāo)本應(yīng)于-70℃長(zhǎng)期保存第31頁(yè),共53頁(yè)。新型甲型H1N1流感檢測(cè)第32頁(yè),共53頁(yè)。核酸提取使用試劑:核酸提取試劑盒QIAGENRNeasyminikit(74104);預(yù)冷的70%乙醇溶液(無(wú)RNase水配制)(自備);β-巰基乙醇(自備)基本步驟:裂解組織,釋放核酸;除去蛋白雜質(zhì);最后獲得核酸產(chǎn)物第33頁(yè),共53頁(yè)。注意事項(xiàng):1提取核酸過(guò)程中使用的所有溶液和耗材必須經(jīng)過(guò)特殊處理,確保無(wú)RNase2操作過(guò)程中必須盡量保持低溫,迅速3操作要在生物安全柜中進(jìn)行,檢測(cè)標(biāo)本樣品和試劑必須在生物安全柜中才可以打開(kāi)操作中必須做好防護(hù),防止降解,污染和感染;4提取好的核酸若不立即進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)于-20℃保存第34頁(yè),共53頁(yè)。RT-PCR檢測(cè)1)反應(yīng)體系配制(25ul體系)(在專(zhuān)門(mén)的生物安全柜中進(jìn)行):使用試劑盒:QIAGENonestepRT-PCRkit(210212)

RNasefreewater

11.9ul5×RT-PCR緩沖液

5ul10mMdNTP

1ulEnzymix

1ulRNasin

0.1ul

上游引物(20uM)0.5ul下游引物(20uM)0.5ul合計(jì)20ul第35頁(yè),共53頁(yè)。對(duì)每一個(gè)建立的反應(yīng)確定反應(yīng)數(shù)(n=擬進(jìn)行的PCR管數(shù),包括陰性,陽(yáng)性對(duì))。考慮到陰性無(wú)模板對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照,誤差,制備過(guò)量的反應(yīng)混合物是必要的。具體如下:(1)如果包括對(duì)照,樣品的數(shù)量(n)為1到14,那么N=n+1;(2)如果包括對(duì)照,樣品的數(shù)量(n)大于15,那么N=n+2。2)將上述反應(yīng)液混勻,分裝到0.2mLPCR小管中,每管20μL,分別做好標(biāo)記。3)加RNA模板(在核酸提取區(qū))將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對(duì)照管(5μL無(wú)菌水),然后分別加標(biāo)本RNA(每管5μL),最后加入陽(yáng)性對(duì)照RNA(每管5μL)。第36頁(yè),共53頁(yè)。反應(yīng)條件:1、60℃ 1分鐘 2、42℃ 10分鐘 3、50℃ 30分鐘 4、95℃ 15分鐘 5、94℃ 30秒 6、50℃ 30秒 7、72℃ 1分鐘 回到第5步 40個(gè)循環(huán) 8、72℃ 10分鐘9、end 第37頁(yè),共53頁(yè)。電泳并觀(guān)察結(jié)果:

提前用1×的TBE緩沖液配制1.5-2%Agrorosegel,膠塊凝固后將其放置在加有1×TBE緩沖液的電泳槽中,電泳緩沖液必須淹沒(méi)膠塊。電泳液最好新鮮配制。PCR結(jié)束后,各取5ulPCR產(chǎn)物和1ul6×LoddingBuffer混勻,點(diǎn)樣,同時(shí)加DL2000Marker5ul,陰、陽(yáng)性對(duì)照;電泳電壓:120V時(shí)間:膠塊的體積和濃度都對(duì)電泳時(shí)間有影響,一般30min-1h。根據(jù)LoddingBuffer中的溴芬蘭指示劑的位置來(lái)判斷電泳的程度,一般藍(lán)色指示條帶泳動(dòng)到膠塊2/3位置處,就可以觀(guān)察結(jié)果了第38頁(yè),共53頁(yè)。第39頁(yè),共53頁(yè)。第40頁(yè),共53頁(yè)。Real-timePCR檢測(cè)體系的配制(25ul體系):RNasefreewater5.75ul2×MasterMix 12.5ulRT-Mix

0.25ulPrimer-1(40uM)

0.5ulPrimer-2(40uM)

0.5ulProbe(10uM)

0.5ul上述成分混勻,每管加入5ul待檢樣品的核酸,封蓋,上機(jī)。樣品多時(shí),同RT-PCR體系的配制方法,混勻分裝。必須同時(shí)設(shè)定陰、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照第41頁(yè),共53頁(yè)。第42頁(yè),共53頁(yè)。反應(yīng)條件:1、60℃5min2、50℃30min3、95℃15min4、95℃15s5、55℃30s6、72℃30s7、readplate8、gotostep4,for45cycles9、72℃5min10、readplate11、end第43頁(yè),共53頁(yè)。第44頁(yè),共53頁(yè)。注意事項(xiàng)RT-PCR引物稀釋方法--工作濃度(20μM) 配制方法:1.10×儲(chǔ)存液配制: (1)將新合成的引物在開(kāi)蓋前短暫離心(12000rpm,15s)。 (2)用RNaseFreeWater溶解,加水量為10×總摩爾數(shù),充分混勻,此時(shí)引物濃度為100pmol/μL,即100μM。 2.引物使用濃度配制:將100μM的引物濃度再5倍稀釋?zhuān)涑蓾舛葹?0μM,即可直接用于PCR反應(yīng)。(請(qǐng)注意各引物管實(shí)際所標(biāo)記的OD數(shù))第45頁(yè),共53頁(yè)。Real-timePCR檢測(cè)引物和探針稀釋方法1.引物工作濃度(40μM)配制方法:(1)將新合成的引物開(kāi)蓋前短暫離心(12000rpm,15s)。(2)用RNaseFreeWater溶解,加水量為10×總摩爾數(shù),充分混勻,此時(shí)引物濃度為100μM,可作為儲(chǔ)存液。(例如:假設(shè)合成引物每管2OD,若1OD的量為4.75nmol(0.00475μmol),則一管引物的總摩爾數(shù)為2×4.75=9.5nmol,加水量為10×9.5=95μl)(3)將100μM的引物2.5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為40μM,可作為工作濃度。2.探針工作濃度(10μM)配制方法:(1)將新合成的探針管開(kāi)蓋前短暫離心(12000rpm,15s)。(2)用RNaseFreeWater溶解,加水量為10×總摩爾數(shù),充分混勻,此時(shí)引物濃度為100μM,可作為儲(chǔ)存液。(3)將100μM的探針10倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為10μM,可作為工作濃度。第46頁(yè),共53頁(yè)。引物、探針稀釋后,-20℃保存陽(yáng)性對(duì)照RNA收到后分裝成若干管,置-20℃或以下保存在試驗(yàn)過(guò)程中,保持所有的試劑在冰架上保持低溫。使用的試劑必須從冷凍狀態(tài)徹底融化混勻后使用(1)分裝好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化(已融的探針避光2-8℃可保存多達(dá)3個(gè)月,不要對(duì)探針?lè)磸?fù)凍融);(2)渦旋振蕩引物和探針;(3)瞬時(shí)離心引物和探針,之后置于冰架上。第47頁(yè),共53頁(yè)。材料及儀器第48頁(yè),共53頁(yè)。

1、RNA提取試劑盒QIAGenRNeasyMiniKit(catalog#74104) 2、β-巰基乙醇(SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115) 3、70%乙醇 4、RT-PCRKit:QIAGENOnestepRT-PCRKit(catalog#210212);QIAGENquanteticprobeRT-PCRkit(catalog#204443) 5、RNasinRibonucleaseInhibitor(Promegacatalo

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