PCR原理及檢測(cè)方法

PCR原理及檢測(cè)方法第1頁(yè)，共53頁(yè)。

一、PCR的定義：

PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱(chēng)體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。第2頁(yè)，共53頁(yè)。

PCR技術(shù)：1985年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上。優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第3頁(yè)，共53頁(yè)。

二、PCR的原理：

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類(lèi)似于天然DNA的復(fù)制過(guò)程。

以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5′末端和3′末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過(guò)程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。第4頁(yè)，共53頁(yè)。

擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合，基本反應(yīng)步驟分三步：1.變性(Denaturation)：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復(fù)性)(Annealling):突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″第5頁(yè)，共53頁(yè)。

3.延伸(Extension):將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3′端開(kāi)始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。72℃1′

上述3步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25～40個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。第6頁(yè)，共53頁(yè)。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第7頁(yè)，共53頁(yè)。第8頁(yè)，共53頁(yè)。第9頁(yè)，共53頁(yè)。

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來(lái)的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。第10頁(yè)，共53頁(yè)。

三、PCR的成分和作用：

1.緩沖液：

10

～50mMTris-Cl(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性25～50mMKCl促進(jìn)引物退火，>50mM會(huì)抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)對(duì)酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類(lèi)似作用。第11頁(yè)，共53頁(yè)。2.MgCl2:

1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴(lài)性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，過(guò)量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過(guò)低則酶活性顯著下降。第12頁(yè)，共53頁(yè)。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.02～0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系，Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2～2.5mM。過(guò)高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過(guò)低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。第13頁(yè)，共53頁(yè)。4.引物(Primer-P)：預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。第14頁(yè)，共53頁(yè)。5.TaqDNA聚合酶：耐高熱0.5～5U/100μl

1U/25～50μl

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低第15頁(yè)，共53頁(yè)。6.模板DNA(Template):最低102～105bpDNA片段，實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)此量，用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1～5μl

過(guò)高：非特異產(chǎn)物增加過(guò)低：產(chǎn)量降低7.水：

去離子水，補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。第16頁(yè)，共53頁(yè)。

四、PCR反應(yīng)體系：

各種成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行核算。第17頁(yè)，共53頁(yè)。

五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、溫度、循環(huán)參數(shù)：

⑴變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再?gòu)?fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第18頁(yè)，共53頁(yè)。

⑵復(fù)性溫度和時(shí)間：

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和G+C含量確定，長(zhǎng)度在15～25bp之間時(shí)，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第19頁(yè)，共53頁(yè)。

⑶延伸溫度和時(shí)間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間，10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá)15分鐘。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72℃1′。

第20頁(yè)，共53頁(yè)。

⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。第21頁(yè)，共53頁(yè)。六、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析常用瓊脂糖凝膠電泳上排：1：marker2：陰性對(duì)照3-17：標(biāo)本（引物為CA16）下排：1-3：標(biāo)本（引物為CA16）4：CA16引物的陽(yáng)性對(duì)照5：marker6：陰性對(duì)照7-14：標(biāo)本（引物為EV71）15：EV71引物的陽(yáng)性對(duì)照第22頁(yè)，共53頁(yè)。RT-PCR技術(shù)RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。第23頁(yè)，共53頁(yè)。Real-TimePCR技術(shù)

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。第24頁(yè)，共53頁(yè)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。第25頁(yè)，共53頁(yè)。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，因而熒光基團(tuán)發(fā)射出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。第26頁(yè)，共53頁(yè)。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。第27頁(yè)，共53頁(yè)。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值（thresholdvalue）。第28頁(yè)，共53頁(yè)。第29頁(yè)，共53頁(yè)。第30頁(yè)，共53頁(yè)。PCR檢測(cè)對(duì)標(biāo)本采集及保存、

運(yùn)輸?shù)囊笱适米?、糞便、皰疹液、腦脊液等。用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本盡早采集。病毒儲(chǔ)存液保存。冷鏈運(yùn)輸，盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。-20℃長(zhǎng)期保存，但是流感樣病例標(biāo)本應(yīng)于-70℃長(zhǎng)期保存第31頁(yè)，共53頁(yè)。新型甲型H1N1流感檢測(cè)第32頁(yè)，共53頁(yè)。核酸提取使用試劑：核酸提取試劑盒QIAGENRNeasyminikit（74104）；預(yù)冷的70%乙醇溶液（無(wú)RNase水配制）（自備）；β-巰基乙醇（自備）基本步驟：裂解組織，釋放核酸；除去蛋白雜質(zhì)；最后獲得核酸產(chǎn)物第33頁(yè)，共53頁(yè)。注意事項(xiàng)：1提取核酸過(guò)程中使用的所有溶液和耗材必須經(jīng)過(guò)特殊處理，確保無(wú)RNase2操作過(guò)程中必須盡量保持低溫，迅速3操作要在生物安全柜中進(jìn)行，檢測(cè)標(biāo)本樣品和試劑必須在生物安全柜中才可以打開(kāi)操作中必須做好防護(hù)，防止降解，污染和感染；4提取好的核酸若不立即進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)于-20℃保存第34頁(yè)，共53頁(yè)。RT-PCR檢測(cè)1）反應(yīng)體系配制（25ul體系）（在專(zhuān)門(mén)的生物安全柜中進(jìn)行）：使用試劑盒：QIAGENonestepRT-PCRkit（210212）

RNasefreewater

11.9ul5×RT-PCR緩沖液

5ul10mMdNTP

1ulEnzymix

1ulRNasin

0.1ul

上游引物(20uM)0.5ul下游引物(20uM)0.5ul合計(jì)20ul第35頁(yè)，共53頁(yè)。對(duì)每一個(gè)建立的反應(yīng)確定反應(yīng)數(shù)（n=擬進(jìn)行的PCR管數(shù)，包括陰性，陽(yáng)性對(duì)）。考慮到陰性無(wú)模板對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，誤差，制備過(guò)量的反應(yīng)混合物是必要的。具體如下：（1）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）為1到14，那么N=n+1；（2）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）大于15，那么N=n+2。2）將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分別做好標(biāo)記。3）加RNA模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對(duì)照管（5μL無(wú)菌水），然后分別加標(biāo)本RNA（每管5μL），最后加入陽(yáng)性對(duì)照RNA（每管5μL）。第36頁(yè)，共53頁(yè)。反應(yīng)條件：1、60℃ 1分鐘 2、42℃ 10分鐘 3、50℃ 30分鐘 4、95℃ 15分鐘 5、94℃ 30秒 6、50℃ 30秒 7、72℃ 1分鐘 回到第5步 40個(gè)循環(huán) 8、72℃ 10分鐘9、end 第37頁(yè)，共53頁(yè)。電泳并觀(guān)察結(jié)果：

提前用1×的TBE緩沖液配制1.5-2%Agrorosegel，膠塊凝固后將其放置在加有1×TBE緩沖液的電泳槽中，電泳緩沖液必須淹沒(méi)膠塊。電泳液最好新鮮配制。PCR結(jié)束后，各取5ulPCR產(chǎn)物和1ul6×LoddingBuffer混勻，點(diǎn)樣，同時(shí)加DL2000Marker5ul，陰、陽(yáng)性對(duì)照；電泳電壓：120V時(shí)間：膠塊的體積和濃度都對(duì)電泳時(shí)間有影響，一般30min-1h。根據(jù)LoddingBuffer中的溴芬蘭指示劑的位置來(lái)判斷電泳的程度，一般藍(lán)色指示條帶泳動(dòng)到膠塊2/3位置處，就可以觀(guān)察結(jié)果了第38頁(yè)，共53頁(yè)。第39頁(yè)，共53頁(yè)。第40頁(yè)，共53頁(yè)。Real-timePCR檢測(cè)體系的配制（25ul體系）：RNasefreewater5.75ul2×MasterMix 12.5ulRT-Mix

0.25ulPrimer-1（40uM)

0.5ulPrimer-2(40uM)

0.5ulProbe(10uM)

0.5ul上述成分混勻，每管加入5ul待檢樣品的核酸，封蓋，上機(jī)。樣品多時(shí)，同RT-PCR體系的配制方法，混勻分裝。必須同時(shí)設(shè)定陰、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照第41頁(yè)，共53頁(yè)。第42頁(yè)，共53頁(yè)。反應(yīng)條件：1、60℃5min2、50℃30min3、95℃15min4、95℃15s5、55℃30s6、72℃30s7、readplate8、gotostep4，for45cycles9、72℃5min10、readplate11、end第43頁(yè)，共53頁(yè)。第44頁(yè)，共53頁(yè)。注意事項(xiàng)RT-PCR引物稀釋方法--工作濃度（20μM） 配制方法：1．10×儲(chǔ)存液配制： （1）將新合成的引物在開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100pmol/μL，即100μM。 2．引物使用濃度配制：將100μM的引物濃度再5倍稀釋?zhuān)涑蓾舛葹?0μM，即可直接用于PCR反應(yīng)。（請(qǐng)注意各引物管實(shí)際所標(biāo)記的OD數(shù)）第45頁(yè)，共53頁(yè)。Real-timePCR檢測(cè)引物和探針稀釋方法1．引物工作濃度（40μM）配制方法：（1）將新合成的引物開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100μM，可作為儲(chǔ)存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若1OD的量為4.75nmol（0.00475μmol），則一管引物的總摩爾數(shù)為2×4.75=9.5nmol，加水量為10×9.5＝95μl）（3）將100μM的引物2.5倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為40μM，可作為工作濃度。2．探針工作濃度（10μM）配制方法：（1）將新合成的探針管開(kāi)蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100μM，可作為儲(chǔ)存液。（3）將100μM的探針10倍稀釋?zhuān)藭r(shí)濃度為10μM，可作為工作濃度。第46頁(yè)，共53頁(yè)。引物、探針稀釋后，-20℃保存陽(yáng)性對(duì)照RNA收到后分裝成若干管，置-20℃或以下保存在試驗(yàn)過(guò)程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。使用的試劑必須從冷凍狀態(tài)徹底融化混勻后使用（1）分裝好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化（已融的探針避光2-8℃可保存多達(dá)3個(gè)月，不要對(duì)探針?lè)磸?fù)凍融）；（2）渦旋振蕩引物和探針；（3）瞬時(shí)離心引物和探針，之后置于冰架上。第47頁(yè)，共53頁(yè)。材料及儀器第48頁(yè)，共53頁(yè)。

1、RNA提取試劑盒QIAGenRNeasyMiniKit（catalog#74104） 2、β－巰基乙醇（SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115） 3、70%乙醇 4、RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）；QIAGENquanteticprobeRT-PCRkit（catalog#204443） 5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalo