犬巴貝斯蟲(chóng)病診斷技術(shù)

1犬巴貝斯蟲(chóng)病診斷技術(shù)注：本文件所稱犬巴貝斯蟲(chóng)病為吉氏巴貝斯蟲(chóng)感染引起的犬巴貝斯GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范3.1犬巴貝斯蟲(chóng)病Caninebabes3.2吉氏巴貝斯蟲(chóng)Babesiagibsoni4縮略語(yǔ)bp：堿基對(duì)（BasePair）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleDTT：二硫蘇糖醇（1,4-DithiothreiDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicaciIPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-25.1流行病學(xué)調(diào)查顯示臨床巴貝斯蟲(chóng)病例中約75％-85％為吉氏巴貝斯蟲(chóng)。1985年我國(guó)南京發(fā)現(xiàn)首例犬感染巴貝斯蟲(chóng)5.2典型臨床癥狀5.2.2貧血：漸進(jìn)性貧血，可視黏膜蒼白至黃染（見(jiàn)附錄C圖C.1中①②)。5.3典型病理變化5.3.3肝臟和脾臟腫大易碎，約為正常犬的2-3倍，甚至3-4倍（見(jiàn)圖C.1中③)。5.4流行特點(diǎn)5.5結(jié)果判定36.2.3姬姆薩染液工作液，按照A.2加甲醇于血涂片，使甲醇完全覆蓋血涂層，待晾干后重復(fù)加姬姆薩染液于已固定好的血涂片，使其完全覆蓋血涂層。室溫條件染色30min。染色結(jié)束之后，47.2.12×RapidTaqMasterMix（商品化）包含TaqDNA聚合酶、延伸促進(jìn)因子、dNTP以及優(yōu)化的7.2.610000×GelRed或綠如藍(lán)核酸染料。7.2.7吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性基因組對(duì)照（用體外純培養(yǎng)的5用商業(yè)化的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的DNA立擴(kuò)增吉氏巴貝斯蟲(chóng)P47基因的引物BgF/BgR按照附錄F中表F.1引物序列合成。配制PCR反應(yīng)體系，然后95℃變性15s，61℃退火15s，72℃延伸1min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。用1×TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物10μL與2μL6×加樣緩沖液混合，加樣于含10000×GelRed或綠如藍(lán)核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠制備的凝膠塊中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm電泳大約30min，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)到底部時(shí)停止電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，并拍照保存。吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性DNA對(duì)照出現(xiàn)1071bp的特異性條帶，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條用特異性引物自待檢樣品基因組DNA中擴(kuò)增出大小為1071bp的條帶，判定為吉氏巴貝斯待檢樣品無(wú)特異性的陽(yáng)性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，判定為吉氏巴貝斯蟲(chóng)核8.2.1吉氏巴貝斯蟲(chóng)BgSA1抗體檢測(cè)6斯蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按照附錄L制備，吉氏巴貝斯蟲(chóng)抗體檢測(cè)試紙條按照附錄M制備，其他相關(guān)試劑按照3000g離心10min，收集上清于1.5mL離心管中，于-20℃保），液，試紙條上將有紅色條帶移動(dòng)。靜置15min，觀在試紙條上出現(xiàn)兩條線（檢測(cè)線和質(zhì)控線見(jiàn)附錄N.1.A）。在試紙條上僅出現(xiàn)一條線（質(zhì)控線見(jiàn)附錄N.19綜合判定7a)出現(xiàn)6.8.1結(jié)果的，判為吉氏巴貝斯蟲(chóng)A.1姬姆薩染液A.2姬姆薩染液工作液gA.5His-bindingBuffer（pH=8.0）NaclNaH2PO4去離子水1.21g9ACTGCAAAAACTGGAGGGGGTGTTGTCCCCCAGGAGTTA③——脾臟腫大，邊緣鈍圓；注：③引自翟曉虎，2022。），假頭基矩形，寬約為長(zhǎng)的1.7倍（包括基突）；兩側(cè)緣幾乎平行；基突強(qiáng)大，三角形，長(zhǎng)與其基部寬約雌蜱：體長(zhǎng)3.29-3.92mm（包括假頭），寬為1.93-2.5側(cè)溝明顯，末端延至眼后。氣門板長(zhǎng)大于寬，呈短逗點(diǎn)形，背突粗短。足基節(jié)I外距直，較內(nèi)距稍短；基節(jié)II~Ⅳ外距粗短，按節(jié)序漸小。跗節(jié)II~Ⅳ腹面亞末端具一鈍齒，末端均具一尖齒。爪墊約達(dá)爪長(zhǎng)雄蜱：體長(zhǎng)3.94-4.77mm（包括假頭），寬為2.20-2.61mm。體型與雌蜱相似。須肢粗短，第I、末端尖細(xì)。氣門板長(zhǎng)逗點(diǎn)形，背突粗短，末端圓鈍。足與雌蟲(chóng)相似。長(zhǎng)角血蜱形態(tài)特征見(jiàn)圖D.1，鐮形扇頭蜱形態(tài)特⑤引自RajeevKungurBrahma,etal.,2014；⑥引自DesmondO.Agwunobi,etal.,2020。采用PCR方法開(kāi)展巴貝斯蟲(chóng)檢測(cè)時(shí)，需合成擴(kuò)增P47基因的引物見(jiàn)表BgR——反向引物；111G.2.1在配制PCR反應(yīng)體系過(guò)程中，陽(yáng)性對(duì)照DNA與待檢樣品DNA應(yīng)該在不同區(qū)域添加，以免造成G.2.2所有試劑應(yīng)按照要求分別在4℃或-20℃條件保存，使用時(shí)在室溫條件下融化，混合均勻，放置用吉氏巴貝斯蟲(chóng)P47基因特異性引物，僅可自吉氏巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性基因組中擴(kuò)增出大小約為1071bpM——核酸分子Marker；用吉氏巴貝斯蟲(chóng)P47基因特異性引物，自待檢樣品基因組中擴(kuò)增出大小約為1071bp的片段（見(jiàn)圖M——核酸分子Marker；ACACAAATAACAACACCTGTGGATGACAATGATTCTGCTCCAATGGAGCCACATTCTGTATGTTACACTTCCTAGGTAAATTGCAGCAGGACACAAACCTGAAAGAAAAGTTTGTCAATGGAGAAGGTAGTTAAGGAGTATCTGGACACCACGCAAGTTGAGAAAAAAGGGTATACTGTTTCGATAGTTTGTTGGAACACGTGAATAAACTACGTCATGAGCTGTTGAACGACACCGGATGGAAAATTTAAGGATCTTAACGAAGAGGGTGTGACAAAGGCTTTTGAAATACTTGTCCGATTCCAATCTTGCACAGTGAGTTTTCGTTGCTGTATTTCCTCTCCTCTACGGAGGGTGGCGGAAATCAATGGATTGAACAATATTTCGGACCAGAGCATACAGGTACACAGGCTGGTTGACTGATAAGTTAAATGAAGCTAAGGACCCTTTCACTGTGAAGAAAGGTTTTGATGATCTAAAACGAGGTGGTAGGATTACCGCAGCTGTGACTGGTAATCTGGGAATAAACCCGGCGGACCTCTAAACTACATGCAATATGGACTGTTTTTCCTTTCTGGTGATACTTTGCGAATCTTGCAAGCGCCCTTCTATTCCTGGCAGAGTTCTGTAGGGAAGTAAGTGAGAACAAGCCCGAGAAGACCACGCTTGATAAATATAAATGTCTTAAGGATGTATGCAAGGATGTAAAATTGATGCTTTTCATAAGCATATTTTGCCTCTATATAATCCTTTAACGGTTGAAGACATAGTGATGACGATAGTAAACTTGGTGAGGTTGTACGCATGGCGGAGGGTAGGTGTAATGACAAAGGAAAGTTAAAAAAAGAGAAATTTGACGAATATGTCACATGGATGAAAAGGAATCTAAACTTATGCTTCTGCTGAGGGAGATGCACACTGACTCTGCCAGATGGACTGTTGAAGATTGTATGTCCAGTCTCATGGACCATCCAAATACGGTTATACGTTCGTGGATAAGAGATGGGAGTATATATTTCACATTTAAGCAGTCTATAGAAGACCTTGCACTTTTTGAATCAAGCAATGGTTAGTCTGCTTAGGTGCTTAGATGGCCAGAGGGCATTAAGAGAGAGGGAAGTCTTTGAAAAAGAAGAAGAAAAGAAAAAGAAAGAAGAGGCTAATAAAAAAGTAAGACGGGTAGCTAAACCCAACTGAGGTTGGAGAAGGAGAGGGGAATTCGTCAGGAAAACAGACACCAGTTCCTACACACTGGTAAGACCCAGTTGAAGGAACAAACACTTGCGGATGGTCATTCTGAAGATCCAAAAAGGGTGCAACTAAGCAGACCTCTGAAACCGTTCCACCTGCTCACCAAACAACAGCCTCCAACAGAAAATGAGGCAGGCCATAAGGCATCAAAGCCAAATGAAACTGAGTCTAACAGAAGGGGTTCCTAAGAAGGAAGAGGAAGTGCCTCAAGAAGGAAAAGGAGATGAGAAAGGTCCATACCTCCGTTAAAGCAAAGGCGGAAGGCACAGCGAATGAGGCATCATTCTCTGCTTTGAGAGTGGCCACAGCATTTTTGGCCCTTTTGTCTGTAATG引物ExpSA1-F-F/ExpSA1-R（20μmol/LBamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，克隆載體pETASY-Blunt，表達(dá)載體pET-28a，感受態(tài)大腸桿菌DH5α,感LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑0.45μm蛋白濃縮管。BamHIXhoI物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α,操作步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。rJ.5.6將透析后的蛋白轉(zhuǎn)入蛋白濃縮管，于4℃4000rpm離心采集符合K.1要求的犬耳尖靜脈血1mL，分離血清犬血清中抗吉氏巴貝斯蟲(chóng)的抗體。當(dāng)出現(xiàn)8.7.2結(jié)果時(shí)符將符合K.2要求的犬頸動(dòng)脈放血至死亡，無(wú)菌收集全該血清即為標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清，分裝于不同規(guī)格的血清瓶或離心管，置于-20℃冰箱將已知染蟲(chóng)率的吉氏巴貝斯蟲(chóng)培養(yǎng)物進(jìn)行2800g2min離心，取下層107個(gè)染蟲(chóng)紅細(xì)胞于無(wú)菌EP管中，加入1mL生理鹽水混勻。選擇符合L.1要求的比格犬，進(jìn)行保定，隨后對(duì)注射位點(diǎn)消毒，將含107脈血1mL，分離血清。用BgSA1抗體檢測(cè)試紙條，檢測(cè)L.2分離的感染前血清和感染后將符合L.3要求的犬頸動(dòng)脈放血至死亡，無(wú)菌收集全部血液，或采集需要量的靜脈血，分離血清。該血清即為吉氏巴貝斯蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清，分裝于不同規(guī)格的血清瓶或離心管，置于-20℃冰箱保存羊抗鼠IgG：用純化的鼠免疫球蛋白免疫山羊后，取羊的B淋巴細(xì)胞，利用雜交瘤技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞融合，篩選制成羊抗鼠抗體。該抗體用于膠體金試紙條硝酸纖維素膜（NC膜）的質(zhì)控線，以此檢驗(yàn)試鼠抗犬IgG：用純化的犬免疫球蛋白免疫小鼠后，取小鼠的B淋巴細(xì)胞，利用雜交瘤技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞融合，篩選制成鼠抗犬抗體。該抗體可與金標(biāo)抗原-吉氏巴貝斯蟲(chóng)抗體復(fù)合物結(jié)合，形成夾心抗原抗用氯金酸制備40nm膠體金顆粒，將SA1重組抗原與膠體金顆粒用配方為2%Tris，4%Casein的封閉液進(jìn)行封閉。標(biāo)記好將重懸好的金標(biāo)記抗原溶液從冰