生物化學(xué) 第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique分子雜交技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術(shù)。樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備分子雜交原理及流程圖

分子雜交種類

按分子種類分為

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA3）蛋白質(zhì)免疫分析—探針為抗體

分子雜交以DNA的變性和復(fù)性為理論基礎(chǔ)。DNA變性：DNA在某些理化因素的作用下堿基對(duì)間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程。DNA的復(fù)性：變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程。

核酸分子雜交：不同來(lái)源的單鏈核酸通過堿基互補(bǔ)形成雜合雙鏈的過程。

一、核酸分子雜交技術(shù)（molecularhybridization）

復(fù)性RNADNA印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。

用放射性核素、生物素、地高辛或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

探針技術(shù)核酸探針（probe）

1、定義：

是一段與被檢測(cè)核酸序列互補(bǔ)的帶有標(biāo)記的核苷酸片段，長(zhǎng)度一般為十幾到幾千個(gè)堿基不等。

2、探針標(biāo)記方法：（1）放射性同位素標(biāo)記（2）生物素標(biāo)記（3）地高辛標(biāo)志物（4）分子信標(biāo)探針可以與目的核酸結(jié)合，對(duì)核酸進(jìn)行定性和定量分析。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology美國(guó)科學(xué)家Kary.Mullis

PCR儀出現(xiàn)之前，PCR是一項(xiàng)十分繁瑣的技術(shù)，同時(shí)需要許多人在一堆試管、秒表和不同溫度的水浴鍋中忙個(gè)不停，甚至還要獨(dú)立的作業(yè)空間防止可能的污染，需要長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)操作，手腳不利落的人是做不來(lái)的。Saiki的結(jié)果則干凈漂亮，讓人心服口服。

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Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理5

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Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。PCR技術(shù)原理示意圖PCR的基本反應(yīng)步驟變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C預(yù)變性94?C最后延伸72?C

錢嘉韻黃石公園的熱泉里發(fā)現(xiàn)的嗜熱菌，成功分離出該細(xì)菌耐高溫的TaqDNA聚合酶。

Mullis雖然提出將TaqDNA聚合酶應(yīng)用到PCR的建議。1986年6月，Saiki首度將其應(yīng)用于PCR，效果就好得驚人，可以說(shuō)是一炮打響。自此，PCR大獲成功。耐熱的DNA聚合酶模板DNA特異性引物（上游引物、下游引物）耐熱DNA聚合酶BufferdNTPsMg2+H2O

PCR體系基本組成成分salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAPCR儀PCR的基本反應(yīng)步驟變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C預(yù)變性94?C最后延伸72?C利用特異性引物以cDNA、基因組DNA為模板獲得目的基因片段；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。

PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR(qPCR)。實(shí)時(shí)PCR分類：實(shí)時(shí)PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法

2.分子信標(biāo)探針法

3.FRET探針法熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。熒光定量PCR原理－－定義非特異性熒光標(biāo)記

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記

TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法SYBRGreenI染料法——原理

SYBRGreenI是能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBRGreenI

SYBRGreenI只有和雙鏈DNA結(jié)合之后才發(fā)熒光熒光定量PCR

使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu)點(diǎn)

對(duì)引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量靈敏度相對(duì)較低無(wú)模板特異性，不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)，非特異性產(chǎn)物需要做熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性缺點(diǎn)SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點(diǎn)熔解曲線分析單一峰，無(wú)非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確有雜峰，有非特異性產(chǎn)物，定量不準(zhǔn)確unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點(diǎn)：特異性高：只有引物和探針都和同一模板結(jié)合時(shí)才能檢測(cè)完全實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：一分子熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)一條DNA鏈的產(chǎn)生多通道檢測(cè)：可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同目的基因序列Taqman探針法Taqman探針：是與目的序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸，5‘端標(biāo)記熒光報(bào)告集團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅集團(tuán)，探針完整時(shí)不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。第三節(jié)基因文庫(kù)GeneLibrary基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。

用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。

二、cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法