某大學(xué)《基因工程》課程考試試卷(含答案)

PAGE第1頁共1頁院系：________________專業(yè)班級：______________姓名：院系：________________專業(yè)班級：______________姓名：_________學(xué)號：_______裝訂線適用專業(yè)試卷所需時間試卷總分100分考試日期開卷/閉卷成績一、名詞解釋（共10小題，每小題1分，共10分）1、粘性末端2、基因工程3、質(zhì)粒的不相容性4、基因組文庫5、克隆(clone)6、電擊轉(zhuǎn)化法7、重組PCR8、限制性酶切圖譜法9、質(zhì)粒10、重組率的定義二、填空題（共10小題，每小題1分，共10分）1、在基因克隆中堿性磷酸單酯酶的主要用途有：A、在用P標記DNA5′端之前；B、在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的，可防止酶切后的載體的與。2、載體的功能是運送高效轉(zhuǎn)入；為外源基因提供能力或能力；為外源基因的或提供必要的條件。三、簡答題（共10小題，每小題4分，共40分）1、載體應(yīng)具備的條件是什么？2、受體細胞應(yīng)具備的條件？3、藍白斑篩選原理是什么？4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？5、酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢是什么？6、營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞的遺傳標記是什么？7、λ-DNA作為載體的優(yōu)點是什么？8、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)特征及優(yōu)勢是什么？9、融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則是什么？10、分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建策略是什么？四、論述題（1-2每小題8分，3-4題每小題12分，共40分）1、論述PCR原理及引物設(shè)計的基本原則。2、強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性是什么？3、請論述λ-DNA載體的構(gòu)建策略是什么。4、請論述植物基因工程的共整合轉(zhuǎn)化程序和二元整合轉(zhuǎn)化程序及二元整合轉(zhuǎn)化程序的特征。院系：________________專業(yè)班級：______________姓名：_________學(xué)號：_______院系：________________專業(yè)班級：______________姓名：_________學(xué)號：_______裝訂線院系：________________專業(yè)班級：______________姓名：_________學(xué)號：_______裝訂線適用專業(yè)試卷所需時間試卷總分100分考試日期開卷/閉卷成績一、名詞解釋（共10小題，每小題1分，共10分）1、粘性末端因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個粘性末端很容易通過互補堿基的配對而重新連接起來。2、基因工程指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。3、質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。4、基因組文庫將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。5、克隆(clone)作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系，作動詞時是指基因的分離與重組過程。6、電擊轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達105/mgDNA。7、重組PCR在兩個PCR擴增體系中,兩對引物分別由其中之一在其5’-端和3’-端引物上帶上一段互補的序列,混合兩種PCR擴增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,兩組PCR產(chǎn)物互補序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng),產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。8、限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。9、質(zhì)粒質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。10、重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)，在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25-75%，重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。二、填空題（共10小題，每小題1分，共10分）1、在基因克隆中堿性磷酸單酯酶的主要用途有：A、在用P標記DNA5′端之前，去除5′端的磷；B、在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的5′磷酸集團，可防止酶切后的載體的自身連接與環(huán)化。2、載體的功能是運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。三、簡答題（共10小題，每小題4分，共40分）1、載體應(yīng)具備的條件是什么？具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點；具有較高的外源DNA的載裝能力；具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點；具有合適的篩選標記。2、受體細胞應(yīng)具備的條件？限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型，用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）具有較高的轉(zhuǎn)化效率，具有與載體選擇標記互補的表型，感染寄生缺陷型，防止重組細菌擴散污染，生物武器除外。3、藍白斑篩選原理是什么？Amoresophisticatedprocedurecanbecarriedoutonasingletransformationplate;Bluewhitescreening;InvolvestheinsertionalinavtivationofthegenelacZ.lacZ’:編碼-半乳糖苷酶a-肽N端，TheinsertionofaDNAfragmentinterruptstheORF（開放閱讀框）oflacZ’gene,resultinginnon-functionalgeneproductthatcannotdigestitssubstratex-gal。4、PCR克隆目的基因的基本程序是什么？由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T5、酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢是什么？全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便；具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉；能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）；酵母菌是最簡單的真核模式生物。6、營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞的遺傳標記是什么？含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因tk能與之遺傳互補。含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細胞（hprt-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標記基因hprt與之遺傳互補。7、λ-DNA作為載體的優(yōu)點是什么？λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌，λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量，重組λ-DNA分子的篩選較為方便，重組λ-DNA分子的提取較為簡便，λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因。8、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)特征及優(yōu)勢是什么？巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。9、融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則是什么？受體細胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件，兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。10、分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建策略是什么？包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細菌內(nèi)外膜的通透性增大。因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細胞。此時，用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細胞，并使用相同性質(zhì)的啟動子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。四、論述題（1-2每小題8分，3-4題每小題12分，共40分）1、論述PCR原理及引物設(shè)計的基本原則。答案要點：PCR是在體外擴增DNA序列的方法，原理并不復(fù)雜，首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。包括：DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA結(jié)合（退火）DNA合成（延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。2、強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性是什么？外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。3、請論述λ-DNA載體的構(gòu)建策略是什么。1）λ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度，野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的（除去非必需區(qū)段，除去左右兩臂必要區(qū)域中的限制位點代以ＭＣＳ，插入選擇位點如Ｌac）。根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA分成兩大類載體：插入型載體，取代型載體。2）λ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點，野生型的λ-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個，同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點。3